Průkaz vybraných patogenů způsobujících kongenitální pneumonii u nedonošených novorozenců pomocí molekulárně biologických metod

Bc. Lucia Baranová

Diplomová práce

Detection of Selected Pathogens Causing Congenital Pneumonia in Preterm Neonates by Molecular Biology Methods

Anotace:

Včasná diagnostika kongenitálních pneumonií způsobených Chlamyda trachomatis, Ureaplasma urealyticum a Ureaplasma parvum je nezbytná z důvodu nedostatečně vyvinutého imunitního systému u předčasně narozených novorozenců. Snahou naší práce proto bylo urychlení detekce DNA těchto patogenů, aby mohla být u těchto pacientů co nejrychleji zahájena cílená antibiotická léčba. Doposud používaná metoda pro průkaz DNA Ch. trachomatis a Ureaplasma spp. je časově náročná (24 až 48 hodin), např. úvodní inkubace při izolaci DNA trvá 14 až 16 hodin. Cílem naší práce proto bylo zkrácení izolačního postupu bez snížení citlivosti detekce DNA. Výsledkem našich pokusů byla optimalizace izolace DNA trvající pouze 1,5 hodiny pro Ch. trachomatis a 3 hodiny pro Ureaplasma spp.. V práci jsme se rovněž zabývali vlivem rychlosti centrifugace. Tento vliv byl pozorován pouze při průkazu DNA Ch. trachomatis, kde 8000 otáček za minutu zlepšovalo možnost jejího záchytu. Ke značnému zrychlení diagnostiky ureaplazmat přispělo i zavedení komerční real-time PCR s využitím přístroje Rotor-Gene 6000, která plně nahradila používanou in-house nested PCR. Dále jsme se zaměřili na preanalytickou fázi vyšetření, tj. určení stability vzorků před a po dodání do laboratoře. V případě aspirátů z dolních dýchacích cest a žaludku u novorozenců je optimální dodání v co nejkratší době, nejpozději do 24 hodin při 4 °C. V případě potřeby (např. přes víkend) je možné zamražení na -20 °C.

Abstract:

Early diagnosis of congenital pneumonia of prematurely born infants is necessary because of their immature immune system. Congenital pneumonia is cause by pathogens Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. The objective of our work was to speed up the detection of DNA of these pathogens so an early treatment of prematurely born infants could promptly begin with antibiotics. The detection method currently used for DNA of Chlamydia trachomatis and Ureaplasma spp. is time-consuming and takes 24 to 48 hours, for instance an initial incubation when DNA is isolated takes 14 to 16 hours. Our goal was to shorten the isolation process without influencing the sensitivity of detection of DNA. A result of our experiments is optimization in isolation of DNA, which takes now only 1.5 hours for Ch. trachomatis and 3 hours for Ureaplasma spp.. We also studied the influence of centrifugation speed. The influence was observed only during detection of DNA of Ch. trachomatis, where 8000 rotations per minute improved its detection. The implementation of a commercial real-time PCR with a Rotor-Gene 6000 device, which fully replaces an in-house nested PCR, contributed significantly to expedite the diagnosis of ureaplasmas. Attention was paid to the preanalytical phase of examination, eg. to specify the stability of samples before and after transport to laboratory. In the case of aspirates of airways and stomach of newborns it is optimal to transport them in the shortest time, within at least 24 hours at 4 °C. If needed, during the weekend, it is possible to freeze them at -20 °C.

Klíčová slova

kongenitální infekce, Chlamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum, Ureaplasma parvum, DNA, PCR, real-time PCR, preanalytická fáze

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 9. 5. 2008

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 6. 2008
• Vedoucí: doc. MVDr. Jaroslava Mazurová, CSc.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů