Molekulární faktory při formování tvrdých tkání: funkce c-Myb a kaspáz v endochondrální osifikaci

Mgr. Bc. Eva Janečková, Ph.D.

Doctoral thesis

Molecular factors in hard tissue development: functions of c-Myb and caspases in endochon-dral ossification

Abstract:

Vývoj tvrdých tkání kostí probíhá cestou osteogeneze a začíná již v embryonálním vývoji. U většiny kostí se nejprve formuje chrupavčitý základ a dochází k endochondrální osifikaci, která je nejčastěji studována na modelu myších končetin. Protože se jedná o atraktivní oblast výzkumu nejenom základního, ale také aplikovaného, celá řada faktorů podílejících se na vývoji kostí je již známa. Nicméně se stále objevují nové prvky signálních drah, případně nové funkce již známých molekul. Mezi takové molekuly patří kaspázy, cysteinové proteázy, tradičně asociované s apoptózou a zánětem, ale se stále jasnějšími funkcemi také mimo tyto procesy. Prvním cílem dizertační práce byl proto screening osteogenního potenciálu kaspáz, který byl proveden s využitím in vitro systému mikromasových kultur a farmakologické inhibice kaspáz. Výsledek ukázal desítky genů, jejichž exprese byla ovlivněna deficiencí kaspáz, z toho u devíti byl rozdíl více než pětinásobný. Nejvíce diskutovanou kaspázou při vývoji kostí je kaspáza-3, proto byl osteogenní účinek inhibice sledován také při izolovaném ovlivnění této kaspázy. Výzkum byl rozšířen o vypracování nového metodického postupu pro kvantifikaci aktivní kaspázy-3 v jednotlivých buňkách. Pro doplnění údajů o neapoptotické funkci kaspáz při vývoji kostí byla další část práce směrována k časoprostorové analýze aktivace kaspáz in vivo s využitím sériových histologických řezů růstové ploténky dlouhých kostí. Aktivované proapoptotické kaspázy mimo apoptotické buňky byly prokázány ve všech zónách růstové ploténky, a to se vzestupným gradientem od klidové k osifikační zóně. Paralelně probíhala specifikace nových funkcí dalších molekul, především c-Myb, na jehož osteogenní potenciál poukázal předchozí výzkum řešitelského pracoviště. V rámci této práce je prezentována časoprostorová analýza exprese c-Myb během endochondrální osifikace. Dizertační práce je předkládána formou komentovaného souboru čtyř vědeckých publikací zveřejněných v časopisech s impakt faktorem.

Abstract:

The development of bone hard tissues undergoes the process of osteogenesis, and it starts in embryonic stages. In most types of bone, a cartilaginous foundation is created first, formed in a process known as endochondral ossification. This process is mostly studied using the limbs of mice as a model. Studying limb development is very interesting for both basic and applied research, thus a lot of information has already been revealed in this area. However, new factors of the signaling pathways are still being discovered and new functions of known molecules are being presented. Among these molecules, caspases, the cysteine proteases, can be found, traditionally associated with apoptosis and inflammation, and with emerging functions beyond these areas. The first aim of this thesis was the screening of caspase osteogenic potential which was performed on the in vitro system of micromass cultures using the pharmacological inhibition of caspases. The expression of several genes was affected by the caspase deficiency for nine of these genes the difference in expression was more than five fold. The caspase most commonly associated with bone development is caspase-3, that is why the next step was to focus our attention on the influence of caspase-3 inhibition on osteogenic markers in the micromass cultures. The research was enriched by a new method for quantification of active caspase-3 in single cells. To fill the missing information about nonapoptotic functions of caspases in bone development, next part of this work was devoted to the investigation of spatial activation of proapoptotic caspases in vivo using the serial histological sections of the long bone growth plate. Active proapoptotic caspases were present in nonapoptotic cells in all zones of the plate and there was a gradient increase in activation from the resting toward the ossification zone. At the same time, other molecules were evaluated for novel function in osteogenesis. Of specific interest was c-Myb. Previously, the results from our laboratory showed its osteogenic potential and as part of this work, the temporospatial analysis of c-Myb expression was presented. The dissertation thesis is presented as a commented set of four scientific papers published in the journals with impact factor.

Keywords

endochondrální osifikace, chondrogeneze, kaspázy, c-Myb, molekulární signalizace

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 10. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 19. 12. 2017
• Supervisor: prof. RNDr. Eva Matalová, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D., prof. MVDr. František Tichý, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology