Developmental expression and localization of END-BINDING 1 c and PHOSPHOLIPASE D ALPHA 1 proteins

Mgr. Dominik NOVÁK

Disertační práce

Regulation of EB1c and PLDa1 proteins by mitogen-activated protein kinases

Abstract:

Tato disertační práce je zaměřena na END-BINDING protein 1c (EB1c) a protein FOSFOLIPASA D ALFA 1 (PLD1) a zahrnuje jejich vývojovou expresi a lokalizaci v semenáčcích Arabidopsis thaliana za použití pokročilých mikroskopických technik. Hlavní kořen vyšších rostlin je anatomicky definován v bočním směru existencí zástupů buněk v konkrétních pletivech, podélně pak přítomností odlišných vývojových zón. Pro rostliny specifický EB1c, který je u Arabidopsis thaliana jedním ze tří členů EB1 proteinové rodiny, vykazuje v nedělících se buňkách kořenové špičky výraznou jadernou lokalizaci. Za použití moderního "light-sheet" fluorescenčního mikroskopu (LSFM) jsme kvantifikovali vývojově regulovanou expresi GFP-značeného proteinu EB1c, která byla kontrolována nativním EB1c promotorem. Kvantifikace byla provedena ve vztahu k velikosti buněčných jader v různých kořenových pletivech (epidermis, primární kůra, endodermis) a v jednotlivých kořenových vývojových zónách (meristém, přechodná a prodlužovací zóna). Naše výsledky podpořily teorii, že v kořenové špičce hraje přechodná zóna jedinečnou úlohu v programování buněk během jejich vývoje při přechodu z rychlého dělení k diferenciaci. Kromě toho byl klonován fúzní konstrukt DRONPA s EB1c pod kontrolou vlastního EB1c promotoru, který byl přechodně transformován do listů Nicotiana benthamiana a stabilně do rostlin Arabidopsis thaliana. Fotoaktivační lokalizační mikroskopie (PALM) ukázala bodovou akumulaci EB1c-DRONPA proteinu v buněčných jádrech. PLD1 protein a jeho produkt kyselina fosfatidová, hrají důležitou roli v mnoha fyziologických a buněčných procesech. Zaměřili jsme se na studium vývojového expresního vzoru a subcelulární lokalizaci tohoto proteinu za použití kombinace LSFM, mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM), mikroskopie s rotujícím diskem a konfokální mikroskopie. Knock-out pld1 mutanti, komplementovaní fúzním proteinem PLD1-YFP pod kontrolou vlastního PLD1 promotoru, vykazovali vyšší akumulaci PLD1-YFP v kořenové čepičce a ve špičkách rostoucích kořenových vlásků. V epidermálních buňkách listů, řapíků a hypokotylů byl PLD1-YFP lokalizován v cytoplazmě, a vykazoval zvýšenou akumulaci v oblasti kortikální cytoplazmatické vrstvy. Nicméně v dělících se kořenových a řapíkových buňkách byl PLD1-YFP obohacený v dělícím vřeténku a fragmoplastu, což naznačila jeho kolokalizace s mikrotubuly. Tato studie ukázala vývojově kontrolovanou expresi a subcelulární lokalizaci PLD1 proteinu jak v dělících se, tak nedělících se buňkách.

Abstract:

This Ph.D. thesis is focused mainly on END-BINDING protein 1c (EB1c) and PHOSPHOLIPASE D ALPHA 1 (PLD1) protein including their developmental expression and localization in Arabidopsis thaliana seedlings using advanced microscopy techniques. Primary root of higher plants is anatomically defined laterally by the existence of cell files in particular tissues and longitudinally by the presence of distinct developmental zones. Plant specific EB1c, one of the three members of EB1 protein family of Arabidopsis thaliana, shows prominent nuclear localization in non-dividing cells in the root apex. Using advanced light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), we quantified developmentally regulated expression levels of GFP-tagged EB1c protein under the control of native EB1c promoter. This was done in relation to the nuclear sizes in diverse root tissues (epidermis, cortex and endodermis) and root developmental zones (meristematic, transition and elongation zone). Our results supported the unique role of the transition root zone in the developmental cell reprogramming during the transition of cells from cell proliferation to cell differentiation in the developing root apex. Moreover, DRONPA-tagged EB1c construct under the control of EB1c native promoter was cloned, transiently transformed to Nicotiana benthamiana leaves and stably transformed to Arabidopsis thaliana plants. Photoactivation localization microscopy showed spot-like accumulation of EB1c-DRONPA in the nucleus. PLD1 and its product phosphatidic acid play important roles in many cellular and physiological processes. Here we aimed to study developmental expression pattern and subcellular localization of PLD1 using combination of LSFM, structured illumination microscopy, spinning disk and confocal microscopy. Complemented knock-out pld1 mutants with YFP-tagged PLD1 under control of PLD1 native promoter showed higher accumulation of PLD1-YFP in the root cap and in tips of growing root hairs. In aerial parts PLD1-YFP was localized in the cytoplasm with enhanced accumulation in the cortical cytoplasmic layer of epidermal non-dividing cells of leaves, petioles and hypocotyls. However, in dividing root and petiole cells PLD1-YFP was enriched in mitotic spindles and phragmoplasts, as suggested by co-visualization with microtubules. This study revealed developmentally-controlled expression and subcellular localization of PLD1 in dividing and non-dividing cells.

Keywords

END-BINDING 1 c (EB1c), AT5G67270, jádro, kořenová špička, vývoj, přechodná zóna kořene, light-sheet mikroskopie, Arabidopsis thaliana, lokalizace, mikrotubuly, FOSFOLIPASA D ALFA 1 (PLD1), AT3G15730

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 6. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. RNDr. Jozef Šamaj, DrSc.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie