Nové alternativní krystalizační techniky používané pro zlepšení morfologie a difrakční kvality proteinových krystalů

Mgr. Ivana TOMČOVÁ

Disertační práce

New alternative crystallization techniques used for improving crystal morphology and diffraction quality of protein crystals

Abstract:

X-ray crystallography is used as a powerful tool to understand how a particular biomacromolecule accomplishes its various functions. In the present study, detailed atomic structure of bacterial di-heme cytochrome c4 isolated for the first time from an anaerobic organism and structure of two crystal forms of sweet protein thaumatin from the African shrub, are presented, as well as an example of how this structural knowledge of cytochrome c4 in combination with biochemical data have been used to classified the protein function. In parallel to modern high-throughput approaches in the crystallization of protein, basic research on their physico-chemical properties and molecular interactions has increasingly gained on importance in recent years. Our aim was to improve the success of any crystallization attempts significantly as well as to find alternative methods of predicting it. In this thesis two novel approaches in macromolecular crystallization are discussed. The first; newly discovered cross-crystallization method alias cross-influence procedure (CIP) with its subsequent application presented on two selected proteins. And the novelty in our second approach is the use of precise temperature-control to drive the crystallization process by keeping system in metastable zone. The understanding that the solubility and phase behavior of proteins is an essential part of the crystallization process, allows us to perform the temperature-controlled experiment (TCE), where the manipulation of the thermodynamics as well as the kinetics of the crystallization process were controlled. In order to improve crystal quality and/or morphology, the both CIP and TCE were found as useful tools in protein crystallization presented by means of crystallization of three different proteins (bacterial cyrochrome c4, glycoside hydrolase family 11 enzyme xylanase and sweet protein thaumatin). Finally, the preliminary crystallization information about three other enzymes (two haloalkane dehalogenase and one membrane protein hydrogenase) are given at the end, as a starting experiment for further X-ray diffraction analysis.

Abstract:

Röntgénová strukúrna analyza predstavuje v dnesnej dobe jeden z najúcinnejsích nástrojov urcenych k rieseniu struktúry a funkcie proteínov. V predkladanej práci je popísaná detailná atómová struktúra bakteriálneho dvojdoménového cytochrómu c4 po prvykrát izolovaného z anaerobného organizmu a atómové struktúry dvoch rôznych krystálovych foriem {\clqq}sladkého`` proteínu {--} thaumatínu izolovaného z Africkej kroviny. Na príklade cytochrómu je ukázané, ako bola pouzitá biochemická analyza spolu s röntgénovou struktúrnou analyzou pri hladaní funkcie tohto proteínu. Popri modernych vysoko-vykonnych metódach krystalizácie proteínov sa v poslednych rokoch coraz viac kladie dôraz na stúdium ich fyzikálno-chemickych vlastností a vyskum molekulovych interakcií. Nasim cielom bolo vylepsit proces hladania podmienok pre rast proteínovych krystálov s pouzitím novych alternatívnych krystalizacnych metod. V tejto práci sú prezentované dva nové prístupy proteínovej krystalizácie. Prvym je nová metóda krystalizácie spocívajúca v pridávaní aditív do okolitych kvapiek, ktoré môzu vplyvom pomalého vyparovania ovlyvnit pH, ci tlak pary nad proteínovou kvapkou bez toho, aby boli v kvapke samotnej prítomné. Druhy prístup spocíva v precíznom kontrolovaní teploty pocas krystalizacného procesu a udrziavania proteínového roztoku v metastabilnom stave. Pri tomto experimente je mozné manipulovat s rastom jednotlivych krystálov a tiet ovplyvnovat nukleáciu novych krystalizacnych jadier. Oba prístupy boli testované na modelovych i nami studovanych proteínoch (cytochróm, xylanáza a thaumatín), vysledkom coho boli získané kvalitnejsie, stabilnejsie a lepsie difraktujúce krystáli. Na záver práce sú prezentované vysledky krystalizácie dalsích troch enzymov, dvoch haloalkán dehalogenáz izolovanych z dvoch rozdielnych baktérií a jedného membránového proteínu {--} hydrogenázy izolovanej z anaerobného organizmu. Tieto vysledky budú dalej pouzité k röntgénovej struktúrnej analyze.

Keywords

rontgenova struturna analyza, cytochrom, thaumatin, xylnaza

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 9. 2007

Zveřejnit od: 13. 9. 2007

Identifikátor: 9684

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 11. 2007
• Vedoucí: Mgr. Ivana Kutá-Smatanová, Ph.D.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Ústav fyzikální biologie

Doktorský studijní program / obor:
Fyzika / Biofyzika