Využití technologie CRISPR/Cas9 pro funkční charakterizaci izoforem kasein kinázy 1 ve Wnt signální dráze

Bc. Tomáš Gybeľ

Diplomová práce

Utilizing CRISPR/Cas9 technology for the functional characterization of casein kinase 1 isoforms in the Wnt signaling pathway

Anotace:

Rodina kasein kinázy 1 (CK1), serin/threonin-specifických protein kináz, se skládá ze šesti izoforem přítomných u člověka. Členové rodiny CK1 jsou významnými regulátory mnoha vývojových signálních drah, jako jsou Wnt, Hedgehog a YAP/TAZ. Z hlediska Wnt signalizace byly izoformy CK1 popsány v kontrole několika klíčových regulačních uzlů Wnt/β-katenin kanonické a Wnt nekanonické signalizační kaskády. Případná redundance jednotlivých izoforem však nebyla komplexně řešena. Jasná disekce jedinečných/společných funkcí jednotlivých izoforem CK1 ve Wnt drahách chybí nebo je zobecněna bez jasných experimentálních důkazů. Cílem této práce bylo vymezit úlohu a redundanci jednotlivých lidských izoforem CK1 prostřednictvím jejich odstranění v buňkách HEK293 s použitím metody CRISPR/Cas9. Připravili jsme několik buněčných linií postrádajících jednotlivé izoformy rodiny CK1 a stejně tak buněčné linie postrádající kombinace izoforem, které byly popsané/očekávané z hlediska redundance. Tyto buněčné linie byly důkladně charakterizovány s ohledem na fosforylaci popsaných cílů CK1 ve WNT3A-indukované Wnt/β-katenin a WNT5A-indukované nekanonické signalizační kaskádě. Popsán byl také celkový výsledek aktivace Wnt dráhy. Naše studie identifikuje jasně odlišné a neredundantní funkce jednotlivých izoforem CK1 v lidských buňkách a pomáhá sladit existující a často protichůdné publikované závěry.

Abstract:

The Casein kinase 1 (CK1) family of serine/threonine-specific protein kinases consists of six isoforms present in human. CK1 family members are significant regulators of multiple developmental signaling pathways such as Wnt, Hedgehog and YAP/TAZ. In terms of Wnt signaling, CK1 isoforms have been proposed to control several key regulatory nodes of Wnt/β-catenin canonical and Wnt non-canonical signaling cascades. However, the possible redundancy of individual isoforms has not been addressed in a comprehensive manner. Therefore, the clear dissection of unique/common functions of individual CK1 isoforms in the Wnt pathways is missing or is generalized without clear experimental evidence. The aim of this thesis was to delimit the role and redundancy of individual human CK1 isoforms through their depletion in the HEK293 cells using CRISPR/Cas9 methodology. We prepared several knockout cell lines lacking individual isoforms of CK1 family, as well as combined knockout cell lines missing several described/expected redundant isoforms. These cell lines were thoroughly characterized with respect to the phosphorylation of the reported CK1 targets upon stimulation with WNT3A-induced Wnt/β-catenin and WNT5A-induced non-canonical signaling cascades. Further, the global outcome of Wnt pathway activation was described. Our study identifies clearly distinct and non-redundant functions of individual CK1 isoforms in human cells and helps to reconcile the existing and often conflicting published reports.

Keywords

kasein kináza 1, CK1, CRISPR, Cas9, Wnt signalizace, Wnt/β-kateninová dráha, Wnt/PCP dráha, fosforylace casein kinase 1, Wnt signaling, Wnt/β-catenin pathway, Wnt/PCP pathway, phosphorylation

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 6. 2019
• Vedoucí: prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Michal Šmída, Dr. rer. nat.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Experimentální biologie / Molekulární biologie a genetika