Kvasinkové rekombinační klonování a jeho využití pro přípravu konstruktů k transformaci Claviceps purpurea, funkční ověření vybraných konstruktů

Bc. Michaela HRADILOVÁ

Diplomová práce

Yeast recombinational cloning ant its use for construct preparation to transform Claviceps purpurea, functional testing of selected constructs

Anotace:

Claviceps purpurea je fytopatogenní houba parazitující na více než 400 rostlinných druzích, zejména žitě, ječmeni a prosu. V infikovaných květenstvích se vytváří tzv. námel, sklerocium s vysokým obsahem námelových alkaloidů. Tyto alkaloidy jsou využívány ve farmaceutickém průmyslu. Pro studium C. purpurea byla v minulosti zavedena metoda genetické transformace. Experimentální přístupy byly navíc usnadněny nedávným sekvenováním genomu C. purpurea 20.1. Vhodnou technikou pro přípravu konstruktů k transformaci C. purpurea je kvasinkové rekombinační klonování, které představuje cenově dostupnou, jednoduchou a vysoce účinnou alternativou klasického klonování. Připravené konstrukty mohou navíc obsahovat fluorescenční značku, tudíž mohou být použity k lokalizaci proteinů, studiu proteinových interakcí či sledování průběhu infekce v hostitelské tkáni. Tato práce je zaměřena na optimalizaci a využití metody kvasinkového rekombinačního klonování k přípravě konstruktů pro transformací C. purpurea. Touto metodou byly připraveny konstrukty pro expresi i deleci vybraných genů C. purpurea. Konstrukty pro expresi genu lpsA1, který kóduje neribosomální lysergylpeptidovou synthetasu LPS1, byly transformovány do dvou kmenů C. purpurea. Pro ověření jejich přítomnosti a funkčnosti byly zvoleny metody diagnostické PCR, qPCR a Western blotu. Metodou epifluorescenční mikroskopie byla určena lokalizace GFP fúzního proteinu. Transformanti byly společně s odpovídajícími kontrolami infikováni na žito. Získaná sklerocia budou testována na změnu v obsahu produkovaných námelových alkaloidů.

Abstract:

Claviceps purpurea is a phytopathogenic fungus which infects more than 400 plant species, especially rye, barley and millet. Late stage of infection is characteristic by formation of ergot, a sclerotium with high content of ergot alkaloids. These alkaloids are widely used in pharmaceutical industry. For study of C. purpurea a method of genetic transformation was impemented in the past. Moreover experimental approaches were facilitated by the recent sequencing of the genome of C. purpurea 20.1. The yeast recombinational cloning that represents an affordable, simple and highly effective alternative to classical cloning is a suitable technique for constructs preparation to transform this fungi. Furthermore the prepared constructs may contain a fluorescent label, therefore they can be used to localize protein of interest, study of protein interactions or monitoring the path of infection in the host tissue. This work is focused on optimizing and utilization of yeast recombinational cloning for preparation of constructs to transform C. purpurea. Using this method constructs for expression and deletion of selected C. purpurea genes have been prepared. The constructs for expression of lpsA1 gene which encodes a nonribosomal lysergylpeptide synthetase LPS1 have been transformed into two strains of C. purpurea. Methods of diagnostic PCR, qPCR and Western blot were chosen to verify their presence and functionality. Using epifluorescence microscopy the localization of GFP fusion protein was done. Transformants and the corresponding controls were infected on rye. Sclerotia will be tested for alternation in content of produced alkaloids.

Klíčová slova

Kvasinkové rekombinační klonování, Claviceps purpurea, lysergylpeptidová synthetasa LPS1

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2016

Zveřejnit od: 22. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Josef Vrabka

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie