Analýza expresního profilu faktorů AHP v závislosti na působení cytokininů a v různých pletivech rostliny Arabidopsis thaliana

Mgr. Jana Hradilová, Ph.D.

Disertační práce

Analysis of the expression pattern in the AHP gene family of Arabidopsis thaliana

Anotace:

Analýza expresního profilu AHP genů Arabidopsis thaliana U vyšších rostlin se dvoukomponentní systém účastní přenosu signálu některých hormonů a reakcí na stres nebo změnu světelných podmínek Faktory s přenašečovou doménou (AHP) transportují fosfátovou skupinu z receptorů umístěných v membránách na regulátory odpovědi. Doposud bylo identifikováno 5 AHP faktorů. RT-PCR byly detekovány dva různé AHP5 PCR produkty (AHP5 a AHP5L), jejichž vzájemný poměr je v jednotlivých částech rostliny různý. Nejvyšší byl tento poměr v květech, nejnižší naopak v šešulích a stoncích. AHP5L obsahoval dva otevřené čtecí rámce (ORF). Přenašečová doména byla zachována v delším z těchto rámců, který je tvořen částí intronu a následujícími exony. Ke kvantifikaci transkriptů jednotlivých AHP genů byla použita metoda RT-PCR v reálném čase a testovány byly vzorky pocházející z listů, kořenů, stonků, květů a šešulí Arabidopsis thaliana. Ve všech těchto vzorcích byly AHP transkripty detekovány, ovšem v rozdílných množstvích. S vysokou orgánovou specifitou se exprimovaly především geny AHP1, AHP2 a AHP4, naopak exprese AHP3 a AHP5 byla přibližně na stejné úrovni. Tutéž metodu jsme použili ke sledování vlivu cytokininů na expresi této genové rodiny v semenáčcích. Byl srovnáván rozdíl v působení exogenně aplikovaných aromatických cytokininů a cytokininů izoprenoidního typu produkovaných enzymem izopentyltransferázou (ipt). Po aktivaci exprese ipt jsme zaznamenali výrazný nárůst derivátů trans-zeatinu a pouze minimální změny v množství ostatních izoprenoidních cytokininů. K přechodnému nárůstu exprese AHP1-4 došlo po krátkodobém působení jak aromatických tak i izoprenoidních cytokininů. Pokud však byly semenáčky kultivovány dlouhodobě v přítomnosti cytokininů, byl pozorován nárůst exprese pouze po aplikaci aromatických cytokininů a nikoliv při dlouhodobé indukci exprese ipt. Toto zjištění je dalším nepřímým důkazem rozdílných vlastností aromatických a izoprenoidních cytokininů.

Abstract:

Analysis of the expression pattern in the AHP gene family Arabidopsis thaliana In higher plants, histidine-aspartate phosphorelays are involved in hormone, stress and light signaling via two-component systems of signal transduction. Histidine-containing phosphotransmitters (AHPs) transfer a phosphoryl group from membrane receptors to effectors in the nucleus. Five AHPs have been identified in Arabidopsis thaliana. Real-time RT-PCR was employed to quantify steady state levels of individual transcripts in leaves, roots, stems, flowers and siliques. The transcripts of all AHPs were detected in every organ examined, although at different levels. High organ specificity of gene expression was found in AHP1, AHP2, AHP4 while expression of AHP3 and AHP5 appears more ubiquitous. We also analyzed the regulation by cytokinins of AHP gene expression. We compared the effects on steady state levels of AHP transcripts of a short-term treatment with an aromatic cytokinin and increase in endogenous isoprenoid cytokinin levels using an activable ipt system in 8-day-old Arabidopsis seedlings. Following ipt activation, a rapid and highly preferential increase in trans-zeatin-type cytokinins was observed while other isoprenoid-type cytokinins showed no or only marginal increases. Transient increases in steady-state levels of AHP1-4 transcripts in response to both the short-term aromatic cytokinin treatment and the increase in endogenous trans-zeatin-type cytokinin levels were observed. On the contrary, increase in steady-state levels of AHP1-4 transcripts observed in seedlings cultivated continuously in presence of exogenous aromatic cytokinin were not paralleled in seedlings with constitutively increased endogenous trans-zeatin-type cytokinins providing further indirect evidence for distinct functions of aromatic and isoprenoid cytokinins. Using RT-PCR we detected two AHP5 specific PCR products (AHP5 and AHP5L). Real-time RT-PCR revealed distinct differences in the ratio between alternately and completely spliced AHP5 mRNAs in the organs investigated. The ratio was highest in flowers and lowest in siliques and stems. Two open reading frames were identified in AHP5L. The conserved part of the phosphotransfer domain remains unaffected in the longer one as the translation initiation at an intron ATG would result in a polypeptide coded by exons 3 to 6 and a short extension encoded by the intron part of the alternative open reading frame.

Klíčová slova

alternativní sestřih, cytokininy, dvou-komponentní systém přenosu signálu, PCR v reálném čase

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 12. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 15. 12. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Břetislav Brzobohatý, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Obecná a molekulární genetika