The role of myeloperoxidase in vascular inflammation

Mgr. Silvie Kremserová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Myeloperoxidáza (MPO), hemoprotein hojně se vyskytující v neutrofilních granulocytech, katalyzuje tvorbu reaktivních metabolitů kyslíku, které jsou rozpoznávány pro jejich mikrobicidní i pro-zánětlivé vlastnosti. Na základě toho, že MPO má klíčovou úlohu v zánětlivých procesech se předpokládá, že MPO je také zapojena v patogenezi cévních onemocnění. Po degranulaci z cirkulujících neutrofilních granulocytů se kladně nabitá MPO naváže elektrostatickou interakcí na povrch endoteliálních buněk, kde podléhá transcytóze a ukládá se v extracelulární matrix (ECM). My jsme ukázali, že se MPO váže k ECM různých buněk a purifikovaným proteinům ECM. Elektrostatická povaha těchto interakcí byla navržena na základě modulačních účinků glykosaminoglykanů. Dále, aktivita MPO byla znásobena po vazbě k vybraným proteinům ECM. Kromě toho, dříve bylo ukázáno, že se MPO váže na leukocyty a významně moduluje jejich chemotaktické funkce a zvyšuje aktivaci neutrofilů. Zde jsme studovali interakci MPO s červenými krvinkami (RBC) a trombocyty. Ukázalo se, že RBC získané z pacientů se zvýšenou plasmatickou hladinou MPO, naznačují významně vyšší množství vázané MPO oproti zdravým kontrolám. Heparinem indukované uvolnění MPO z RBC izolovaných z pacientů bylo signifikantně vyšší oproti kontrolám. Ex vivo experimenty ukázaly vazbu MPO k povrchu RBC a trombocytům v závislosti na koncentraci a čase. Infuze RBC ovlivněných MPO do myší zvyšuje lokální koncentraci MPO v různých tkáních. Dále byla zachována peroxidázová aktivita MPO po vazbě MPO ke krevním destičkám. Částečná aktivace trombocytů MPO byla dokázána zvýšením exprese povrchových receptorů trombocytů, jak bylo prokázáno zvýšením interakce MPO ovlivněných trombocytů s neutrofily. Dalším důležitým mechanismem regulujícím rozvoj chronického zánětlivého procesu je odstraňování neutrofilních granulocytů nahromaděných v místě zánětu. Zdá se, že MPO může ovlivňovat tento proces díky jejímu zapojení v indukci buněčné smrti neutrofilů. Jako model byl použit lipopolysacharidem vyvolaný zánět plic u myší. Je zajímavé, že myši deficientní na MPO mají významně zvýšený počet infiltrovaných neutrofilnů v dýchacích cestách a vyšší hladinu RANTES ve srovnání s kontrolními myšmi. Je pozoruhodné, že neutrofily izolované z MPO deficientních myší ukazují sníženou míru buněčné smrti vyznačující se povrchovou expresi fosfatidylserinu. Dalším hodnocením tohoto procesu se ukázalo, že buněčná smrt neutrofilních granulocytů ovlivněných MPO neukazuje klasické znaky procesu apoptózy. Dále jsme také studovali procesy autofágie. Navrhujeme, že v procesu povrchové exprese fosfatidylserinu v neutrofilech jsou zapojeny i jiné granulární proteiny, jako neutrofilní elastáza. Lze tedy shrnout, že data prezentována v této práci poskytují nový pohled na molekulární mechanismy založené na elektrostatické interakci MPO s proteiny ECM ovlivňující katalytickou aktivitu MPO. Jak trombocyty, tak RBC mohou vázat MPO v periferní cirkulaci a MPO může indukovat priming trombocytů. RBC mohou sloužit jako nosič MPO a podporovat transport MPO do periférních míst a ovlivňovat funkci endotelu. Tyto účinky mohou přispívat k rozvoji chronických zánětlivých procesů v cévách. Dále, důležitá role MPO v regulaci průběhu zánětu plic, nezávisle na jejich mikrobicidních funkcích, může být případně spojena se schopností MPO modulovat životnost neutrofilů a ovlivňovat akumulaci chemotaktických faktorů v místě zánětu. Celkově tyto výsledky rozšiřují naše znalosti o významu MPO v zánětlivých procesech a podporují MPO jako terapeuticky důležitou cílovou molekulu v léčbě zánětlivých onemocnění.

Abstract:

Myeloperoxidase (MPO), abundant hemoprotein in neutrophils, catalyzing a generation of reactive oxygen species that are recognized for their microbicidal as well as pro-inflammatory properties. Based on the MPO key role in the inflammatory processes, an importance of MPO in the pathogenesis of vascular diseases can be suggested. Upon the degranulation from circulating neutrophils, cationic MPO binds to the surface of endothelial cells in an electrostatic-dependent manner and undergoes transcytosis and deposition in the underlying extracellular matrix (ECM). We showed that MPO binds to ECM derived from variety of cells and to purified ECM proteins. The electrostatic nature of these interactions was proposed based on the modulating effects of a glycosaminoglycans. Furthermore, the MPO activity upon binding to selected ECM proteins was potentiated. Additionally, previously was shown that MPO binds to leukocytes and significantly modulates their chemotactic functions and increases neutrophil activation. Herein, we studied MPO interactions with red blood cells (RBC) and thrombocytes. RBC derived from patients with elevated MPO plasma levels showed significantly higher amounts of bound MPO than healthy controls. Accordingly, heparin-induced MPO-release from patient-derived RBC was significantly increased compared to controls. Ex vivo experiments revealed dose and time dependent biding of MPO to surface of RBC and thrombocytes. Infusion of MPO-loaded RBC into mice increased local MPO concentrations in various tissues. Further, MPO peroxidase activity was preserved upon the MPO binding to thrombocytes. The partial activation of thrombocytes by MPO was documented by MPO-mediated increase in the expression of surface thrombocyte receptors, what was shown by increasing interaction of MPO-treated thrombocytes with neutrophils. Another important mechanism regulating development of chronic inflammatory process is clearance of neutrophils accumulated at the site of inflammation. MPO was suggested to affect this process through involvement of induction of neutrophil cell death. As a model was employed the lipopolysaccharide-induced lung inflammation in mice. Interestingly, MPO-deficient mice had significantly increased numbers of airway infiltrated neutrophils and higher levels of RANTES compared to wild-type mice. Remarkably, MPO-deficient neutrophils revealed a decreased rate of cell death characterized by phosphatidylserine surface expression. Further evaluation of this process showed that this MPO affected neutrophil cell death does not reveal classical markers of apoptotic process. We have also studied processes of autophagic cell death. Furthermore, we propose that in the process of the surface expression of phosphatidylserine in neutrophils are involved also other granular proteins, as neutrophil elastases. Altogether, the data presented in this thesis provide new insights into the molecular mechanisms underlying the electrostatic interaction of MPO with ECM proteins affecting MPO catalytic activity. Both thrombocytes and RBC may avidly bind MPO in peripheral circulation, and MPO can induce priming of thrombocytes. RBC can act as MPO’s carrier and transport it to the peripheral sites, and affect endothelial function. These effects can contribute to the development of chronic inflammatory processes in vessels. Finally, the important role of MPO in the regulation of the course of pulmonary inflammation, independent of its putative microbicidal functions, can be potentially linked to MPO ability to modulate the life span of neutrophils and affect accumulation of chemotactic factors at the site of inflammation. Overall these data further widen our knowledge about significance of MPO in inflammatory processes and support MPO as therapeutically important target molecule for treatment of inflammatory disorders.

Keywords

Myeloperoxidáza, zánět, neutrofilní granulocyty, buněčná smrt, kardiovaskulární onemocnění, myeloperoxidase, inflammation, neutrophils, cell death, cardiovascular diseases.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 1. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 15. 1. 2016
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Antonín Lojek, CSc., Dr. rer. nat. Martin Mollenhauer, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology