Vyhledávání rostlinných extraktů s Nrf2 aktivitou

Karolína KOVAŘÍKOVÁ

Bachelor's thesis

Screening of plant extracts with Nrf2 activity

Abstract:

Tato bakalářská práce se zabývala vyhledáním rostlinných extraktů, které aktivují dráhu transkripčního faktoru Nrf2 a tím vykazují protirakovinnou aktivitu. Testování probíhalo na buněčných liniích EpRE-LUX, s luciferázovým reportérem odvozené od myšího elektrofilního responzivního elementu, a HepG2-GFP, odvozené od lidského hepatocelulárního karcinomu. Teoretická část této práce se zabývala charakterizací antioxidačního systému a transkripčního faktoru Nrf2, který se nachází v buněčné cytoplazmě v inaktivním komplexu s proteinem Keap 1. Disociací proteinu Keap 1, způsobenou biologicky aktivními látkami, se stává Nrf2 aktivním a tím spouští regulaci genů kódujících antioxidační stresové proteiny a antioxidační enzymy druhé fáze. V experimentální části byla provedena extrakce rostlinného materiálu, tedy kůry a dřeně granátového jablka, sušených plodů kustovnice čínské a suchého prášku rostlin camu camu a moringy olejodárné. Těchto pět extraktů bylo testováno na buněčné linii EpRE-LUX pro stanovení luciferázové aktivity. Z výsledků měření byl vyhodnocen jeden extrakt jako aktivní, a to z rostliny moringy olejodárné. Tento aktivní extrakt byl dále frakcionován na osm frakcí na reverzní fázi C18, dále na šest frakcí iontoměničovou chromatografií, konkrétně na tři frakce na katexu a na tři frakce na anexu. Extrakty těchto frakcí byly následovně testovány na obou buněčných liniích pro stanovení luciferázové a fluorescenční aktivity. Aktivní frakce byly podrobeny necílené analýze LC-MS. Výsledkem byla detekce tří majoritních metabolitů, které byly předběžně identifikovány pomocí MS/MS spekter a literatury jako deriváty quercetinu a luteolinu - konkrétně quercetin-3-O-hexosid, quercetin-3-O-(6´´-malonylhexosid) a luteolin-7-O-(6´´-malonyl)glukosid.

Abstract:

This bachelor thesis dealt with the screening of plant extracts that activate the pathway of transcription factor Nrf2 and thus show anti-cancer properties. Cellular testing was done on EpRE-LUX cell line, with a luciferase reporter gene, derived from a murine electrophilic responsive element, and HepG2-GFP cell line, derived from human hepatocellular carcinoma. The theoretical part of this thesis dealt with the characterization of an antioxidant system and a transcription factor Nrf2 which is in the cytoplasm in an inactive complex with its repressor protein Keap 1. The dissociation of Keap 1 protein, which can be caused by biologically active substances, makes the Nrf2 active. Activated Nrf2 starts the regulation of genes that code antioxidant stress proteins and antioxidant second phase enzymes. The experimental part of this thesis started by the extraction of plant material - a bark and pulp of the fruit of Punica granatum L., dried fruit of Lycium chinense, and powder of Myrciaria dubia and Moringa oleifera. These five extracts were tested on EpRE-LUX cell lineto measure luciferase activity. Results showed one active extract, from Moringa oleifera. This active extract was fractionated to eight fractions on reverse phase C18 and to six fractions by ion-exchange chromatography, specifically to three cation exchanger fractions and three anion exchanger fractions. Extracts of these fractions were tested on both cell lines. Those which showed both luciferase and fluorescent activity underwent LC-MS analysis. The result of this analysis was the detection of three major metabolites which were preliminarily identified by MS/MS spectra and literature as quercetin and luteolin derivates. Those derivates were quercetin-3-O-hexoside, quercetin-3-O-(6´´-malonylhexoside) and luteolin-7-O-(6´´-malonyl)glucoside.

Keywords

antioxidační systém, frakcionace, Keap 1, LC-MS, Nrf2

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 6. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Jiří Grúz, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology