Vliv složek mléka na expresi MUC- 2 u Caco-2 buněk a HT29-MTX buněk

Helena Horáková

Bachelor's thesis

Effect of milk components on MUC-2 expression in Caco-2

Abstract:

Konzumace mléka a mléčných výrobků je opakovaně v lidovém povědomí dávána do souvislosti se zahleňováním. Hlen je směs glykoproteinů, mucinů a jiných látek vytvářených specializovanými slizničními buňkami. Má ochranný vliv na jeho složení a míra exprese může mít široké souvislosti. Například v trávicím traktu je hlen poskytovatelem vazebných míst pro komensální a symbiotickou mikrofloru, substrátem, ochrannou vrstvou nebo signální látkou. Produkce a složení mucinu je velmi obtížné studovat in vivo, zejména pak u lidí. Z tohoto důvodu jsou široce uplatňovány modely umožňující některé tyto vztahy simulovat. Cílem práce bylo zjistit, nakolik může přidání mléka zvýšit produkci a expresi mucinu (MUC2) v modelu lidského tenkého střeva založeného na liniiích nádorových buněk Caco-2 a HT29- MTX. V in vitro směsném modelu nádorových buněk Caco-2 a HT29-MTX narostlých v souvislé vrstvě na polystyrenovém podkladu byl studován efekt přídavku hydrolyzovaného mléka vůči kontrole a byla stanovena exprese genu pro MUC-2 s pomocí RT-PCR a komerčně dostupných primerů. Před vlastním experimentem byly vybrány vhodné netoxické koncentrace mléčného hydrolyzátu na základě stanovení cytotoxicity (IC50) za použití MTT testu na Caco-2, HT29-MTX buňkách a ko-kultuře Caco-2/HT29-MTX. Z experimentu je zřejmé, že po aplikaci hydrolyzátu kravského mléka se exkrece MUC-2 zvětšila téměř třikrát oproti normálnímu fyziologickému stavu. MUC-3 se vylučoval 4,5krát více než je normální fyziologický stav bez kontaktu s mlékem. Nejméně ze všech zkoumaných mucinů se vylučoval MUC-13, kdy se jeho exkrece zvýšila dvakrát oproti normálnímu fyziologickému stavu. Naproti tomu největší zaznamenané vylučování měl MUC-17, který se vyloučil až 5krát více oproti normálnímu fyziologickému stavu. Předpokládaná hypotéza, že přítomnost mléka a jeho složek v modelu zvyšuje expresi a sekreci mucinu MUC-2, byla provedeným experimentem potvrzena. Výsledky analýzy qRT-PCR pro čtyři různé geny mucinu (MUC2, MUC3, MUC13 a MUC17) ukazují, že po kontaktu buněk s hydrolyzátem mléka se exkrece mucinů prokazatelně zvýšila a to až několikrát oproti běžnému fyziologickému stavu.

Abstract:

Milk consumption of milk and dairy products has often in folk awareness been linked to mucus production. Mucus is a mixture of glycoproteins, mucins and other substances produced by specialised mucosal cells. It has a protective effect and its composition and degree of expression may have a wide context. For example, in the digestive tract mucus provides binding sites for commensal and symbiotic microbiota, the substrate, protective layer or the signal substance. It is very difficult to study production and composition of mucin in vivo, especially in humans. For this reason, there are widely applied models to stimulate some of these relationships. The aim of this thesis was to find whether adding of milk may increase the production and expression of mucin (MUC-2) in intestinal human model based on a cancer cell lines Caco-2 and HT29-MTX. In in vitro mixture model of tumor cells Caco-2 and HT29-MTX grown in a layer of the PS was studied the effect of the addition of hydrolysed milk compared to the control and was determined the gene expression for MUC-2 by using the qPCR and commercially available primers. Prior the experiment, appropriate concentrations of milk hydrolysate were selected based on cytotoxicity screening (IC50) by using the MTT assay on Caco-2, HT29- MTX cells, and co-culture of Caco-2/HT29-MTX. From the experiment is evident that after the application of cow's milk hydrolysate the excretion of MUC-2 increased three times more than the normal physiological state. Mucin-3 was secreted 4.5 times more than the normal physiological state without contact with the milk. From of all tested mucin was the excreted at least the MUC-13, when the excretion increased 2 times from the normal physiological condition. In contrast, the largest excretion had MUC-17, which increased 5 times more than the normal physiological state. Hypothesis was carried out, the presence of milk and its components in the model increases the expression and secretion of mucin MUC-2, an experiment confirmed. Analysis results of qRT-PCR in four different genes mucin (MUC2, MUC3, MUC13 and MUC17) show that after contacting the cells with the hydrolysate of milk mucins excretion demonstrably increased up several times compared to the normal physiological condition.

Keywords

mucin, exprese, mléko, zahleňování, hlen, MUC-2

Keywords

MUC-2, mucin, expression, milk, mucus production, mucus

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Jaroslav Havlík, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Nutrition and Foodstuffs