Substrátová specifičnost a imobilizace rostlinných aminoaldehyddehydrogenas

Mgr. Jan FRÖMMEL

Disertační práce

Substrate specificity and immobilization of plant aminoaldehyde dehydrogenase

Anotace:

Rostlinné aminoaldehyddehydrogenasy (AMADH) katalyzují oxidaci -aminoaldehydů na aminokyseliny s redukcí koenzymu NAD+. V rámci aldehyddehydrogenas (ALDH) se řadí do rodiny ALDH10 spolu s bakteriálními avšak mimo živočišné AMADH, které tvoří rodinu ALDH9. Díky široké substrátové specifičnosti se rostlinné AMADH podílí na řadě metabolických drah, kam patří degradace polyaminů, tvorba osmoprotektantů, popř. syntéza karnitinu z lysinu. Jde o homodimerní či homotetramerní proteiny s aktivním místem tvořeným Cys, Asn a Glu. Nejobvyklejším substrátem je 3-aminopropanal (APAL), ovšem oxidují i další přirozené aminoaldehydy: 4-aminobutanal (ABAL), 4-(trimethylamino)butanal, 4-guanidinobutanal, 4-(3-aminopropylamino)-butanal či betainaldehyd. V disertační práci byla studována substrátová specifičnost isoenzymů z hrachu (PsAMADH1 a 2) a rajčete (SlAMADH1 a 2). Vzhledem k heterocyklickým aldehydům vykazuje nejšiřší substrátovou specifičnost SlAMADH1. Pyridinkarbaldehydy jsou slabšími substráty než pyridinylpropanaly. Oxidace halogenderivátů 4-pyridinkarbaldehydu a benzaldehydu probíhá pouze tam, kde se substituce nenachází ve vicinální poloze vzhledem k aldehydové skupině. -(Pyridinylmethylamino)butanaly jsou výrazně lepšími substráty než -(pyridinylmethylamino)propanaly. Acylaminoaldehydy jsou substráty obou PsAMADH, přičemž deriváty APALu jsou lepší než příslušné deriváty ABALu. Aldehydy vyskytující se v lihovinách se předpokládaly jako substráty SlAMADH1. Enzym byl imobilizován na nanočástice z maghemitu. Takto upravené nanočástice byly vloženy do mikroelektrochemické cely s elektrodami z platiny, Ag/AgCl a uhlíkové pasty s obsahem maghemitových nanočástic, kde byly fixovány pomocí externího magnetu. Po přídavku vzorku lihoviny do elektrochemické cely a reakci byla měřena koncentrace vzniklého NADH lineární voltametrií. Biosenzor lze použít ke stanovení obsahu aldehydů v lihovinách, ale nelze s jeho pomocí určit přesné zastoupení jednotlivých aldehydů

Abstract:

Plant aminoaldehyde dehydrogenases (AMADH) catalyze the oxidation of -aminoaldehydes to amino acids using NAD+ as a coenzyme. Within the aldehyde dehydrogenase (ALDH) superfamily, they belong to the ALDH10 family together with bacterial AMADHs but separately from mammalian enzymes forming the ALDH9 family. Their substrate specificity is very broad. AMADH participate in many metabolic pathways such as polyamine degradation, production of osmoprotectants or synthesis of carnitine. Plant AMADHs are homodimeric or homotetrameric proteins. The active site is formed by Cys, Asn and Glu. The most common natural substrate is 3-aminopropanal (APAL) but other natural aminoaldehydes are accepted as well. This thesis has been devoted to studying the substrate specificity of AMADH isoenzymes from pea (PsAMADH1 and 2) and tomato (SlAMADH1 and 2). SlAMADH1 has the broadest specificity towards heterocyclic aldehydes. Pyridine carbaldehydes are weaker substrates than pyridinyl propanals. Only halogenderivates of 4-pyridinylcarbaldehyde or benzaldehyde, which do not contain the substitution at the vicinal position to the aldehyde group, are oxidized. -(Pyridinylmethylamino)butanals are better substrates than -(pyridinylmethylamino)propanals. N-acyl--aminoaldehydes are subtrates of both PsAMADHs. APAL derivates are better substrates than the respective ABAL derivates. Aldehydes occuring in spirits were expected as substrates of SlAMADH1. In order to construct a biosensor, SlAMADH1 was immobilized on maghemite nanoparticles. Immobilized enzyme was placed into a microelectrochemical cell and fixed by an external magnet. The cell contained three electrodes produced from platinum, Ag/AgCl or carbon paste containing maghemite nanoparticles. After adding a sample of spirit and reaction, the concentration of NADH was meassured by linear sweep voltametry. The biosensor is usable to determaine the total concentration of aldehydes in spirits, but i tis not able to provide an information on the quantity of any single adehyde.

Klíčová slova

Aminoaldehydy, Aminoaldehyddehydrogensa, substrátová specifičnost, imobilizace enzymu

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 10. 2014

Zveřejnit od: 20. 10. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 11. 2014
• Vedoucí: prof. Mgr. Marek Šebela, Dr.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie