Strukturní analýza proteinových komplexů fotosyntetického aparátu rostlin pomocí transmisní elektronové mikroskopie

Iveta KOZAROVÁ

Bakalářská práce

Structural analysis of protein complexes of photosynthetic apparatus of higher plants using a transmission electron microscopy

Anotace:

Tato práce se zabývá problematikou kombinace nativní polyakrylamidové gelové elektroforézy pro separaci pigment-proteinových komplexů fotosyntetického aparátu rostlin a následně optimalizací jejich šetrné extrakce z gelu pro účely strukturní analýzy pomocí transmisní elektronové mikroskopie. Teoretická část pojednává o výhodách a nevýhodách jednotlivých technik nativní elektroforézy a zejména o bezbarvé nativní elektroforéze (CN-PAGE). Tato technika je vynikajícím nástrojem pro separaci proteinů a proteinových komplexů v jejich intaktním stavu. Dále je v teoretické části popsáno složení základních komponent fotosyntetického aparátu rostlin (fotosystém I (PSI) a fotosystém II (PSII)), pojednáváno o elektronové mikroskopii a o metodách přípravy vzorku pro elektronovou mikroskopii. Experimentální část se zabývá optimalizací podmínek izolace a separace PSII superkomplexů z thylakoidních a granálních membrán (BBY) ječmene jarního (Hordeum vulgare) a optimalizací procesu extrakce separovaných superkomplexů PSII z polyakrylamidového gelu pro účely elektronové mikroskopie. Jelikož byl kladen důraz na zachování intaktnosti separovaných superkomplexů, tak jako šetrný způsob extrakce byla testována samovolná eluce proteinů z gelu do pufru. Významným výsledkem experimentální práce je úspěšná separace superkomplexů PSII z BBY membrán, které se z hlediska výtěžnosti PSII komplexů osvědčily lépe, než thylakoidní membrány. Proces eluce separovaných superkomplexů PSII z polyakrylamidového gelu byl monitorován pomocí měření 77K fluorescenčních emisních spekter, která vypovídají jednak o koncentraci a dále pak o intaktnosti eluovaných superkomplexů PSII. Z obdržených výsledů vyplývá, že dvouhodinová eluce superkomplexů PSII byla optimální pro podmínky elektronové mikroskopie.

Abstract:

This work deals with a combination of native polyacrylamide gel electrophoresis for separation of pigment-protein complexes of photosynthetic apparatus of plants and a subsequent optimization of their gentle extraction from a gel for aims of structural analysis using transmission electron microscopy. The theoretical part deals with advantages and disadvantages of various techniques of native electrophoresis, especially about the clear-native electrophoresis (CN-PAGE). This technique is an excellent tool for the separation of proteins and protein complexes in their intact state. Furthemore, there is described a composition of essential components of the photosynthetic apparatus of plants (photosystem I (PSI) and photosystem II (PSII)), electron microscopy in the theoretical part and methods of specimen preparation for the electron microscopy are introduced. The experimental part is focused on an optimization of conditions of isolation and separation of PSII supercomplexes from thylakoid and grana membranes (BBY) of spring barley (Hordeum vulgare) and an optimization of extraction process of separated PSII supercemplexes from polyacrylamide gel for the aims of the electron microscopy. Since an emphasis on maintaining of intactness of the separated supercomplexes was put, a spontaneous elution of proteins from gel into buffer was tested as gentle method of extraction. A successful separation of PSII supercomplexes from BBY membranes was an important result of the experimental work. It was proven that BBY membranes give a higher yield of PSII complexes compared to thylakoid membranes. The process of a spontaneous elution of the separated PSII supercomplexes from polyacrylamide gel was monitored by a measurement of 77K fluorescence emission spectra, which reflex both a concentration and an intactness of eluted PSII supercomplexes. The obtained results show that two-hour elution of PSII supercomplexes was optimal for conditions of electron microscopy.

Klíčová slova

Bezbarvá nativní elektroforéza, pigment-proteinový komplex, thylakoidní membrána, fotosystém II, elektronová mikroskopie, Hordeum vulgare

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 13. 5. 2013

Zveřejnit od: 13. 5. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2013
• Vedoucí: RNDr. Roman Kouřil, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie