Haloalkane dehalogenase from unique plant-pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens C58: Biochemical characteristics and engineering

S.Si. Khomaini Hasan, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Halogenalkandehalogenasy (HLDs) jsou enzymy katalyzující štěpení vazby uhlík-halogen. HLDs byly izolovány z různých bakterií, včetně degradujících, symbiotických, extremofilních či patogenních kmenů. O tyto enzymy je velký zájem díky jejich potenciálnímu využití v oblastech biosensingu, bioremediací nebo v průmyslové biokatalýze. Tato práce se věnuje charakterizaci a proteinovému inženýrství nové HLD s označením DatA z rostlinného patogena Agrobacterium tumefaciens C58. Gen datA je lokalizován na Ti plasmidu A. tumefaciens (GenBank: AE009425). Fylogenetická analýza prokázala příslušnot DatA k podrodině HLD-II. Překvapivé bylo zjištění, že na rozdíl od ostatních známých HLD, DatA neobsahuje na jedné z pozic halogenid stabilizujících aminokyselin nutných pro katalýzu tryptofan, ale tyrosin. Toto specifikum společně s původem enzymu dělají z DatA zajímavý cíl pro detailnější studium. Biochemická charakterizace úspěšně exprimovaného a purifikovaného enzymu prokázala některé specifické vlastnosti DatA. Sekundární struktura enzymu odpovídá struktuře dalších známých HLDs, které patří do skupiny /-hydroláz. Také teplota tání DatA (48.3 ± 0.2 °C) je srovnatelná s ostatními HLDs. Aktivitní optimum DatA bylo pozorováno ve 40 °C při pH 9.8. Nativní polyakrylamidová gelová elektroforéza potvrdila, že DatA je dimer. Analýza substrátové specifity prokázala vysokou aktivitu enzymu s bromovanými a jodovanými substráty a nízkou aktivitu s chlorovanými substráty. Kinetika enzymu je substrátově závislá. Z praktického hlediska pak stojí za pozornost především vysoká enantioselektivita DatA naměřená s racemickými směsmi chirálních bromovaných alkanů a esterů. Strukturní a funkční role jedinečné halogenid stabilizující aminokyseliny byla studována proteinovým inženýrstvím. Halogenidstabilizující tyrosin 109 byl mutován za tryptofan, který je v této pozici přítomný v ostatních HLDs. U výsledné mutantní varianty DatA došlo ke zvýšení teploty tání proteinu. Zvýšení stability proteinu může být vysvětleno posílením hydrofobních interakcí a van der Waalsových kontaktů v jádru proteinu. Studium mutantní varianty DatA dále prokázalo zvýšenou vazbu halogenidu a zvýšenou vazebnou afinitu k většině z testovaných substrátů. Rychlost chemické reakce se u většiny substrátů naopak snížila. Vnesení mutace též vedlo ke změnám v mechanismech kooperativity a substrátové inhibice enzymu. Rychlost limitující krok DatA, hydrolýza reakčního intermediátu alkyl-enzym, zůstal nezměněn. Biochemicky charakterizovaná DatA se stává novým užitečným biokatalyzátorem enzymové rodiny HLDs.

Abstract:

Haloalkane dehalogenases (HLDs) are enzymes catalysing the cleavage of the carbon-halogen bonds. These enzymes have been isolated from various bacteria including degrading, symbiotic, extremophilic or pathogenic strains. HLDs are of great interest due to their possible application in biosensing, bioremediation and industrial biocatalysis. This Thesis is devoted to the characterization and protein engineering of the new HLD designated DatA from plant pathogenic bacterium Agrobacterium tumefaciens C58. The gene datA is located on the Ti plasmid of A. tumefaciens (GenBank: AE009425). The phylogenetic analysis revelaed that DatA belongs to the HLD-II subfamily. Interestingly, DatA carries a tyrosine instead of tryptophan, which is commonly employed by other HLDs as one of its halide-stabilising residues, necessary for the enzymatic reaction. This speciality together with its origin make DatA a suitable target for a more detailed study. Biochemical characterization of the successfully expressed and purified DatA revealed some specific properties of this enzyme. Secondary structure of DatA resembles the other characterized HLDs possessing /-hydrolase fold. Also the melting temperature (48.3 ± 0.2 °C) is comparable with other HLDs. The activity optimum of DatA was observed at 40 °C and pH 9.8. Native polyacrylamide gel elecrophoresis revealed the dimeric structure of DatA. Analysis of the substrate specificity of DatA revealed its high activity towards brominated and iodinated compounds, but poor activity towards the chlorinated compounds. An unusual substrate-dependent kinetic patterns were obtained during the kinetic analysis of DatA. Most importantly, DatA showed an excellent enantioselectivity towards racemic mixtures of chiral brominated alkanes and esters. The structural and functional role of the unique halide-stabilising residues was probed by the protein engineering. The halide-stabilising tyrosine 109 was substituted by tryptophan, in order to make the composition of the catalytic pentad of DatA similar to other HLDs. The resulting mutant showed increased melting temperature due to improved hydrophobic packing and strengthened van der Waals contacts in the protein core. The DatA mutant also displayed increased halide binding affinity, but reduced catalytic rate towards most of the substrates. Mutation also modified the kinetic cooperativity and the substrate inhibition, without altering the rate-limiting step of DatA. Biochemically characterized DatA will become a useful biocatalyst in the toolbox of HLDs.

Keywords

Halogenalkandehalogenasy, Agrobacterium tumefaciens, proteinové inženýrství, halogen-stabilizující aminokyseliny Haloalkane dehalogenase, protein engineering, halide-stabilising residues

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 10. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 31. 10. 2012
• Vedoucí: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr.
• Oponent: Mgr. Pavel Mazura, Ph.D., Mgr. Marek Petřivalský, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie