Kvantifikácia proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie a jej využitie pri sledovaní degeneračných zmien proteínu

Karina Blaženiaková

Bakalářská práce

Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a její využití při sledování degeneračních změn proteinů

Anotace:

Posttranslační modifikace proteinů můžou mít důležitou roli v regulačních dráhách, některé z nich sú však výsledkem stresového působení a stárnutí proteinů. Táto bakalářská práce,Kvantifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie a její využití při sledování degeneračních změn proteinů, stručně sumarizuje hlavní posttranslační modifikace související s degeneračními procesy. Experimentální část využívá cílenou analýzu metodou SRM hmotnostní spektrometrie na identifikaci potenciálních míst posttranslačných modifikací. S využitím dostupné lokální spektrální knihovny Hordeum vulgare, byl vybrán vysoko abundantní protein endospermu obilky ječmenu (Serpin-Z4) a optimalizovaná metoda pro cílenou analýzu jeho tryptických peptidů. Celkem bylo sledovaných 14 peptidů reprezentujících víc než 50 % sekvence proteinu. Poškození bylo indukováno inkubací homogenizovaných obilek při teplotě 99 °C po dobu 0,5 - 24 h a též inkubací s peroxidem vodíku s koncentrací 0 - 30 %. Teplotní střes významně snížil zastoupení 7 peptidů a oxidační stres významně snížil zastoupení 4. Mapování těchhle peptidů na 3D strukturu proteinu ukázalo, že většina peptidů s pozměněným zastoupením je pravděpodobně lokalizována na povrchu molekuly a tedy představuje očekávaný cíl stresem vyvolaných modifikací. Nakonec byla vytvořená metoda SRM testována i na extraktech z potravin.

Abstract:

Protein posttranslational modifications may play an important role in regulatory pathways but some of them are also the result of stress and protein ageing. This thesis Protein quantitation and its application in the monitoring of degenerative protein modifications briefly reviews major protein posttranslational modifications involved in degenerative processes. The experimental part utilises SRM-based targeted mass spectrometry to identify sites of stress-induced posttranslational modifications. Based on the available spectral libraries, a highly abundant barley seed protein was selected (Serpin-Z4) and the method for a targeted analysis of its tryptic peptides was optimised. Altogether, relative abundances of 14 peptides representing more than 50% of the protein sequence coverage were followed. The damage was induced by incubating barley seed powder at 99°C for 0.5-24 h or with hydrogen peroxide (0-30%). Abundances of seven and four peptides were significantly dicreased by heat and oxidative damage, respectively. The mapping of these peptides to the protein's 3D structure revealed that most of the altered peptides are exposed on the surface and thus present a likely target of stress-induced modifications. Finally, the SRM-based method was tested on food extracts.

Abstract:

Posttranslačné modifikácie proteínov môžu mať dôležitú úlohu v regulačných dráhach, niektoré z nich sú však výsledkom stresového pôsobenia a starnutia proteínov. Táto bakalárska práca, Kvantifikácia proteínov pomocou hmotnostnej spektrometrie a jej využitie pri sledovaní degeneračných zmien proteínu, stručne sumarizuje hlavné posttranslačné modifikácie súvisiace s degeneratívnymi procesmi. Experimentálna časť využíva cielenú analýzu metódou SRM hmotnostnej spektrometrie na identifikáciu potenciálnych miest posttranslačných modifikácií. S využitím dostupnej lokálnej spektrálnej knižnice Hordeum vulgare, bol vybraný vysoko abundantný proteín endospermu obilky jačmeňa (Serpín-Z4) a optimalizovaná metóda pre cielenú analýzu jeho tryptických peptidov. Celkom bolo sledovaných 14 peptidov reprezentujúcich viac ako 50 % sekvencie proteínu. Poškodenie bolo indukované inkubáciou homogenizovaných obiliek pri teplote 99 °C po dobu 0,5 - 24 h a tiež inkubáciou s peroxidom vodíka s koncentráciou 0 - 30 %. Teplotný stres významne znížil zastúpenie siedmych peptidov a oxidačný stres významne znížil zastúpenie štyroch peptidov. Mapovanie týchto peptidov na 3D štruktúru proteínu ukázalo, že väčšina peptidov s pozmeneným zastúpením je pravdepodobne lokalizovaná na povrchu molekuly a teda predstavuje očakávaný cieľ stresom vyvolaných modifikácií. Nakoniec bola vytvorená SRM metóda testovaná aj na extraktoch z potravín.

Klíčová slova

posttranslační modifikace, LC-MS, SRM, stárnutí, stes

Keywords

stres, posttranslational modifications, LC-MS, SRM, starnutie

Klíčová slova

starnutie, LC-MS, stres, posttranslačné modifikácie, SRM

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 4. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Martin Černý, Ph.D.
• Oponent: Tomáš Takáč, externi

Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Agrobiologie / Molekulární biologie a biotechnologie