Vývoj metody stanovení relativní exprese genu CD151 kódujícího tetraspaninový protein ve varleti a nadvarleti koně domácího s využitím termocykleru LightCycler® Nano (Roche)

Bc. Natálie Poláková

Master's thesis

Development of a method for determining the relative expression of the CD151 gene encoding the tetraspanin protein in the testis and epididymis of a domestic horse using the LightCycler® Nano (Roche) thermocycler

Abstract:

Tetraspaniny jsou transmembránové proteiny vyskytující se v membránách téměř všech eukaryotických buněk. Prostřednictvím reorganizace membránových komplexů se podílí na mnohých fyziologických i patologických procesech. Jedním z těchto procesů je oplodnění. Přestože jsou mechanismy skrývající se za fúzí gamet během oplodnění stále předmětem zkoumání, předpokládá se, že ze všech 33 tetraspaninových proteinů exprimovaných u savců se do oplození zapojují tři – CD9, CD81 a CD151. Výzkum exprese genu CD151 je důležitým krokem v odhalení fyziologické funkce kódovaného proteinu. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout metodu pro stanovení relativní genové exprese CD151 ve tkáni varlete a nadvarlete koně a dále detekovat exprimované transkripční varianty genu. U koňského genu CD151 byla na základě referenčního genomu předpokládána exprese šesti transkripčních variant X1-X6. Tkáně varlete a tří anatomických částí nadvarlete – hlavy (caput), těla (corpus), ocasu (cauda) – byly odebrány ve dvou biologických replikátech. Celkem bylo analyzováno 40 vzorků. Z těchto tkání byla izolována RNA, proběhla reverzní transkripce a následovala kvantitativní Real-Time PCR (qRT-PCR) za použití specifických primerů. Jako housekeepingový gen byl vybrán gen ACTB. Byly navrženy specifické primery, jejichž amplifikace byla ověřena analýzou teploty tání, určením eficience reakce, separací amplikonů v elektroforéze, restrikčním štěpením amplikonu a sekvenací. Všechny primery byly specifické. Jeden pár primerů byl vybrán pro hodnocení obecné relativní exprese genu CD151 a čtyři páry primerů byly vybrány pro detekci a rozlišení transkripčních variant. Všechny sestřihové varianty s výjimkou X1 byly detekovány ve varleti i nadvarleri. Exprese varianty X1 je předpokládána, ale nebylo možné navrhnout primery tak, aby byla možná její detekce. Sekvenace amplikonů primerů určených pro stanovení relativní exprese prokázala, že je amplifikace vysoce specifická a že primery amplifikují stejnou sekvenci ve všech zkoumaných tkáních. Získaná sekvence odpovídala sekvenci genu CD151 v referenčním genomu nejen koně domácího, ale také dalších zástupců rodu Equus. Relativní exprese CD151 byla vyhodnocena na základě qRT-PCR, jejíž výsledky byly dále statisticky zpracovány. Gen CD151 byl exprimován ve všech tkáních, ale vyskytovaly se rozdíly v míře exprese. Ve všech třech částech nadvarlete byla relativní exprese znatelně nižší než ve varleti. V nadvarleti byla nejvyšší exprese naměřena v hlavě nadvarlete. Exprese v těle a ocasu nadvarlete byla srovnatelná. Při porovnání míry exprese mezi jednotlivými hřebci byly hodnoty srovnatelné vždy mezi dvojicí jedinců. Rozdíly v genové expresi mezi hřebci mohly být způsobeny nevhodnou manipulací se vzorky a degradací vstupní RNA. Řešení diplomové práce bylo podpořeno projekty GA FAPPZ Studium geneticky podmíněných vlastností s využitím molekulárně-genetických, bioinformatických a statistických metod (SV20-9-21360), Molekulární analýza nukleových kyselin rostlin a živočichů a možnosti jejího hodnocení s využitím metod bioinformatiky a biostatistiky (SV19-07-21360) a projektu CIGA Zlepšení mrazitelnosti hřebčích spermií přidáním proteinů semenné plazmy do kryokonzervačního média (2018200).

Abstract:

Tetraspanins are transmembrane proteins found in the membranes of almost all eukaryotic cells. Through the reorganization of membrane complexes, they participate in many physiological and pathological processes. One of these processes is fertilization. Although the mechanisms behind gamete fusion during fertilization are still under investigation, it is assumed that out of all 33 tetraspanin proteins expressed in mammals, three are involved in fertilization – CD9, CD81 and CD151. Research focused on the expression of gene CD151 is an important step in revealing the physiological function of the encoded protein. The aim of this diploma thesis was to develop a method for determining the relative gene expression of CD151 in the testis and epididymis of a horse and to further detect transcript variants of the gene expressed in the tissue. Based on the reference genome, the equine CD151 gene was predicted to be expressed in the form of six transcript variants X1-X6. Tissue of the testis and three anatomical parts of the epididymis – head (caput), body (corpus), tail (cauda) were collected in two biological replicates. A total of 40 samples were analyzed. RNA was isolated from the tissue, reverse transcribed and analyzed by quantitative Real-Time PCR (qRT-PCR) using specific primers. The ACTB gene was selected as the housekeeping gene. Specific primers were designed. The amplification was verified by melting curve analysis, determination of reaction efficiency, separation of amplicons by electrophoresis, restriction digestion of the amplicon and sequencing. All primers were specific. One primer pair was selected to assess the general relative expression of the CD151 gene and four primer pairs were selected to detect and distinguish transcript variants. All splice variants except X1 were detected in the testis and the epididymis. Expression of the X1 variant is expected, but it was not possible to design the primers to specifically detect only this variant. Sequencing of amplicons synthesizes by the primers, which were chosen as a marker of relative gene expression, showed that the amplification was highly specific and that the primers amplified the same sequence in all examined tissues. The obtained sequence corresponded to the sequence of the CD151 gene in the reference genome of the horse and also of other members of the Equus genus. The relative expression of CD151 was evaluated by qRT-PCR, the results were further statistically analyzed. The CD151 gene was expressed in all tissues but there were differences in the level of expression. In all three parts of the epididymis, the relative expression was significantly lower than in the testis. In the epididymis, the highest expression was measured in the head of the epididymis. The expression in the body and the tail of the epididymis was comparable. When comparing the level of expression between individual stallions, the values were comparable between a pair of individuals. Differences in gene expression between stallions could be due to improper sample handling and degradation of input RNA. The solution of the diploma thesis was supported by projects GA FAFNR Study of genetic conditions using molecular-genetic, bioinformatic and statistical methods (SV20-9-21360), Molecular analysis of nucleic acids of plants and animals and the possibility of its evaluation using methods of bioinformatics and biostatistics (SV19- 07-21360) and the CIGA project Improving the freezing ability of stallion sperm by adding seminal plasma proteins to the cryopreservation medium (2018200).

Keywords

Equus caballus, gen CD151, tetraspaniny, exprese, qRT-PCR, transkripční varianty, kůň domácí

Keywords

the horse, Equus caballus, CD151 gene, tetraspanins, expression, qRT-PCR, transcript variants

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology