Oxidativní stres kančích spermií a možnost jeho modulace gasotransmitery.

Ing. Martin Kadlec

Doctoral thesis

Oxidative stress in boar spermatozoa and its possible modulation by gasotransmitters

Abstract:

Oxidační stres představuje hlavní překážku v širším využití technik asistované reprodukce v chovu prasat. K oxidačnímu stresu dochází v momentě, kdy přirozené antioxidační systémy nezvládají kontrolovat koncentraci vysoce reaktivních sloučenin. Mezi vysoce reaktivní sloučeniny lze řadit i H2S a NO, které zároveň spadají do skupiny plynných signálních molekul označované jako gasotransmitery. Účinek NO a H2S se odvíjí od jejich koncentrace. V rámci fyziologické koncentrace se podílejí na klíčových dějích ve spermii v průběhu jejího životního cyklu. Zvýšená koncentrace těchto gasotransmiterů má naopak fatální dopad na fertilizační potenciál spermie. Pro omezení negativního dopadu oxidačního stresu se využívají antioxidanty, přičemž antioxidační vlastnosti mohou vykazovat i oba gasotransmitery, NO a H2S, v závislosti na jejich koncentraci. Pro udržení fyziologické koncentrace NO lze využít aminoguanidin, který inhibuje inducibilní syntázu oxidu dusnatého. Aktivita tohoto enzymu je typická pro leukocyty během zánětlivých reakcí imunitního systému a umožňuje produkci velkého množství NO. K hlavním zdrojům oxidačního stresu v kančím ejakulátu patří právě leukocyty přítomné v semenné plazmě. V této práci aminoguanidin vykazoval silný antioxidační účinek a pomohl ochránit kančí spermie před oxidačním stresem v in vitro podmínkách, což se pozitivně projevilo na funkčních vlastnostech. Antioxidační vlastnosti byly popsány také u donorů H2S. V druhé části práce byly porovnány rychlý donor sulfanu, Na2S, který uvolňuje velké množství H2S v krátkém časovém úseku, a pomalý donor sulfanu, GYY4317, který uvolňuje menší množství sulfanu v delším časovém úseku. Poprvé byly popsány antioxidační vlastnosti obou donorů, kdy pomalý donor GYY4317 vykazoval silnější antioxidační schopnost, která měla stabilní vzrůstající tendenci. Oproti tomu rychlý donor Na2S vykazoval menší a nestabilní antioxidační schopnosti. Tomu odpovídali i další výsledky, kdy byl prokázán pozitivní vliv obou donorů sulfanu na funkční parametry spermie. Zatímco GYY4317 vykazoval pozitivní účinek v celém rozsahu koncentrace (3-300 μM), rychlý donor Na2S vykazoval pozitivní účinek v nízkých mikromolárních koncentracích (3-30 μM) a cytotoxický účinek při 300 μM koncentraci. Tento divergentní účinek rychlého a pomalého donoru H2S odpovídá povaze vysoce reaktivních sloučenin. Vzhledem k vysoké reaktivitě obou gasotransmiterů se zdá být pravděpodobná interakce NO s H2S, která už byla prokázána u somatických buněk. V poslední části práce byla poprvé nepřímo prokázána interakce obou gasotransmiterů za využití SNP (donor NO) a NaHS (rychlý donor H2S). Simultánní aplikace 100 SNP nM a 100 nM NaHS vedla k zachování progresivní motility a integrity membrány u kančích spermií v přítomnosti oxidačního stresu. Individuální aplikace těchto donorů NO a H2S o stejné koncentraci nevykazovala pozitivní účinek na kančí spermie, avšak aplikace SNP vedle k částečnému zlepšení některých funkčních parametrů spermií bez signifikantních výsledků. Lze spekulovat, že interakcí těchto dvou gasotransmiterů dochází k formování metabolitu se silnějším signálním účinkem než samotný NO. Výsledky disertační práce poskytly originální poznatky v oblasti využití gasotransmiterů při modulaci oxidačního stresu u kančích spermií. Bylo potvrzeno, že jejich účinek je závislý především na koncentraci. Regulací koncentrace gasotransmiterů směrem k fyziologickým hodnotám lze dosáhnout protektivního účinku, kdy si spermie zachovávají funkční vlastnosti a zvyšuje se jejich antioxidační kapacita v in vitro podmínkách. Zároveň je z práce zřejmé, že pro plné pochopení ú

Abstract:

lohy gasotransmiterů v biologii spermií je zapotřebí dalšího výzkumu.

Abstract:

Oxidative stress represents a major obstruction in the wide use of assisted reproduction techniques in pig breeding. Oxidative stress is defined as the moment when natural antioxidant systems fail to control the concentration of highly reactive substances. Among such substances can be listed also NO and H2S which belong to the group of gaseous signalling molecules known as gasotransmitters. The effect of NO and H2S depends on their concentration. Under physiological concentrations, both gasotransmitters are involved in crucial processes during the life cycle of a sperm cell. On the other hand, elevated concentrations of H2S and NO result in a detrimental impact on sperm cell fertilization potential. Antioxidants are used to reduce the negative impact of oxidative. Interestingly, both gasotransmitters, NO and H2S, may exert antioxidant properties depending on their concentration. Aminoguanidine can be used to maintain the physiological concentration of NO as it inhibits the activity of inducible nitric oxide synthase. The activity of this enzyme is common for leucocytes in the course of an inflammatory reaction of the immunity system and it provides the production of large amounts of NO. The leucocytes present in boar semen constitute one of the major sources of oxidative. This thesis demonstrated the high antioxidant properties of aminoguanidine whose application protected boar spermatozoa from oxidative stress and positively correlated with the functional parameters of sperm cells. Antioxidant properties were also described for donors of the other gasotransmitter, H2S. In the second part of the thesis, the fast-releasing H2S donor (Na2S) and slow-releasing H2S donor (GYY4317) were compared. For the first time, the antioxidant properties of both donors were described under in vitro conditions. The slow donor GYY4137 exerted greater and more stable antioxidant capacity with an increasing tendency. On the other hand, the fast donor Na2S exerted lesser and unstable antioxidant properties. Accordingly, the next results of the thesis proved the positive effect of both donors, NaHS and GYY4137, on the functional parameters of sperm cells. While the fast-releasing donor GYY4137 exerted a positive effect in the whole range of concentration (3-300 μM), the slow-releasing donor Na2S exerted a positive effect only at low μM concentration and cytotoxic effect at 300 μM concentration. This divergent action of fast- and slow- releasing donors of H2S corresponds to the nature of highly reactive substances. Due to the high reactivity of each gasotransmitter, the direct interaction between NO and H2S seems likely which was proven in somatic cells already. The last section of the thesis has proven indirectly for the very first time the interaction between the two gasotransmitters using SNP (NO donor) and NaHS (H2S donor). The sample with these two donors applied simultaneously each at 100 nM concentration led to the preservation of progressive motility and membrane integrity of boar spermatozoa under oxidative stress. Individual application of each donor at the same concentration did not improve sperm quality traits, yet SNP seemed to partially improve some of the functional parameters of boar spermatozoa although the results were not significant. This leads to speculation that metabolites with greater signalling potency are formed upon the interaction of these two gasotransmitters than the sole action of NO alone. This thesis provided unique findings regarding the application of gasotransmitters for the modulation of oxidative stress in boar spermatozoa. In accordance with the previous knowledge, it was verified that the effect of the two gasotransmitters, NO and H2S, depends on their concentration. The regulation of these two gasotransmitters towards the physiological levels leads to a protective effect resulting in the preservation of functional properties of boar spermatozoa and the increase of antioxidant capacities under in vitro condi

Abstract:

tions. The obtained data also underline the need for further investigation regarding the role of gasotransmitters in the biology of sperm cells.

Keywords

spermie, oxidační stres, gasotransmitery, oxid dusnatý, sulfan

Keywords

spermatozoa, oxidative stress, gasotransmitters, nitric oxide, hydrogen sulfide

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 10. 2022

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme:
Animal Science