Studium interakcí hPOT1 s jednořetězcovými G- a C-bohatými přesahy telomerické DNA.

Bc. Michala Bučková

Master's thesis

Study of hPOT1 interactions with single stranded 5’-G-rich and 3’-C-rich telomeric DNA overhangs.

Abstract:

Telomery jsou nukleoproteinové komplexy, které ochraňují chromozomy před spoje-ním jejich konců nehomologní rekombinací nebo fúzí homologní. Telomery vyskytu-jící se u savců končí na 3‘ konci G-bohatým jednořetězcovým převisem, který obsahu-je šestinukleotidové repetice TTAGGG, které jsou přidávány enzymem telomerázou. Jedno řetězcový převis je chráněn proteinem POT1, který je součástí šesti proteino-vého komplexu shelterinu. Tento komplex brání rozpoznání telomer DNA opravnými mechanismy. Některé rakovinné buňky prodlužují telomery alternativním mecha-nismem založeným na homologní rekombinaci (ALT). Telomery prodlouženy tímto mechanismem mohou obsahovat nukleotidové záměny v repetitivní sekvenci. Při chronické lymfocytární leukemii (CLL) dochází k prodlužování telomer ALT mecha-nismem. Zároveň byly v CLL identifikovány mutace DNA vazebných domén proteinu POT1, které mohou rušit jeho interakci s kanonickou telomerickou DNA repeticí. Na základě těchto faktů jsme vytvořili hypotézu, že mutantní varianty proteinu POT1 jsou schopny vazby alternativních telomerických repetic. K ověření hypotézy jsme připravili sérii mutantních variant proteinu POT1, které jsme následně produkovali v buňkách linie HEK293T. Interakce s oligonukleotidy byly testovány metodou EMSA. Tím jsme identifikovali nukleotidovou záměnu v alternativní telomerické repetici, která obnovuje vazbu mutantních variant proteinu POT1.

Abstract:

Telomeres are nucleoprotein complexes that protect chromosomes from end to end fusion or homologous recombination. In mammals, telomeres are terminated with single-stranded 3‘ G-rich overhang consisting of TTAGGG repeats, synthesized by te-lomerase. The single-stranded overhang is bound by POT1 protein, a member of mul-tiprotein sheltering complex that prevents recognition of the telomere end by DNA damage response pathways. Some cancer cells employ mechanism for alternative lengthening of telomeres (ALT) that is dependent on homologous recombination in-stead of telomerase. Telomeres prolonged by ALT mechanism may contain nucleotide substitutions in the repetitive sequence. In chronic lymphocytic leukemia (CLL), mu-tations in DNA binding domains of POT1 have been identified that potentially abolish its interaction with the canonical telomeric repeat. Concurrently, CLL cells use the ALT mechanism of maintaining the telomere length. Therefore, we hypothesize that POT1 protein bearing CLL-related amino acid substitutions can interact with alterna-tive variants of telomeric repeats resulting from ALT. To map binding of POT1 to va-rious telomeric DNA repeats, we prepared a series of mutant POT1 constructs that were expressed in HEK293T cells and tested for the interaction using Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA). With this approach, we have identified single nucleotide exchange in telomeric repeat sequence that rescues binding of CLL-related POT1 mu-tants.

Keywords

telomery, telomerická DNA, shelterin komplex, POT1, ALT, mutantní varianty, EMSA

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 7. 6. 2023
• Supervisor: doc. Mgr. Lukáš Trantírek, Ph.D.
• Reader: MUDr. Libor Macůrek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Genomics and Proteomics