NEW APPROACHES TO PHYTOHORMONE ANALYSIS IN PLANTS

Mgr. Jan ŠIMURA

Disertační práce

New approaches of phytohormone analysis in plants.

Abstract:

Dissertation thesis is mainly dedicated to the development of new analytical methods for plant hormone analysis utilizing targeted metabolomic approach and the application of these newly developed methods (and well-established ones) in plant hormone determination with a focus on signalling and crosstalk. Information about plant hormone levels are often valuable and important in studies concerned with plant growth and development and deepen our knowledge about their occurrence and function. The characteristic of all hormones is that they are typically found in tissues in minute concentrations (10-10 10-15 mol/g). Thus, direct quantification in complex plant extracts requires a combination of effective isolation protocol and selective and sensitive analytical instrument. The primary objective of this thesis was development of analytical protocol including sample preparation (extraction and purification) and a method based on ultra-high performance liquid chromatography combined with tandem mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) for complex phytohormone analysis. Combined, providing a tool for simultaneous determination of more than 100 compounds (precursors, active compounds, and metabolites) from auxin, cytokinin, gibberellin, brassinosteroid, jasmonic acid, abscisic acid, and salicylic acid families. Solid phase extraction (SPE) based on hydrophilic-hydrophobic interactions was used for effective removal of plant pigments while maintaining high recovery of the targeted compounds. UHPLC was used for optimal separation of targeted compounds and tandem mass spectrometry utilizing multiple reaction monitoring (MRM) was used for their precise determination. The SPE-UHPLC-MS/MS method was validated on material from Arabidopsis thaliana var. Columbia and first used for complex targeted plant hormone profiling in roots and shoots of 14 days old A. thaliana seedlings exposed to salt stress for last 48 hours prior harvest. Furthermore, a miniaturized method for tRNA bound cytokinin extraction was developed, and used for determination of cytokinin content in Physcomitrella patens and algal and cyanobacteria species. Also, well established methods were used for cytokinin and auxin determination in segmented shoots of rootless aquatic carnivorous plants Aldrovanda vesiculosa and Utricularia australis and their dormant organs (turions). Results were furthermore discussed in conjunction with formerly described physiological aspects of these plants' life cycle (e.g. rapid apical growth, nutrient allocation, photosynthesis, or senescence). Herein, findings pointed out the importance of detailed screening of compounds from one phytohormone family as well as the importance of plant hormone profiling in wider context. Results from this dissertation thesis contribute to the introduction of routine, sensitive methods for the determination of plant hormones allowing monitoring the interactions of these substances (crosstalk) and to study their metabolic pathways.

Abstract:

Disertační práce je zaměřena na vývoj analytických metod využívajících nástrojů cílené metabolomiky ke studiu rolí rostlinných hormonů (fytohormonů) při regulaci vývojových procesů u rostlin. Tato strukturně různorodá skupina aktivních látek hraje nezastupitelnou roli v komunikaci mezi rostlinnými buňkami, pletivy a orgány. Ukazuje se, že různé hormonální signální dráhy jsou provázány a propojeny v jednotnou síť stimulů a odpovědí. Informace o hormonálních hladinách jsou často cenným a důležitým doplňkem molekulárně-biologického bádání a prohlubují naše znalosti o jejich účinku. Fytohormony se v rostlinách nacházejí v nízkých koncentracích (10-10 10-15 mol/g) a jejich studium vyžaduje kombinaci efektivního izolačního postupu a selektivní a citlivé analytické koncovky. Hlavním cílem práce je vyvinutí optimální extrakční, purifikační metody a následné separační a detekční metody využívající ultra vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii ve spojení s tandemovým hmotnostním spektrometrem (UHPLC-MS/MS) umožňující stanovení více než stovky látek (prekurzorů, biologicky aktivních látek a metabolitů) z rodin auxinů, cytokininů, giberelinů, brassinosteroidů, salicylové kyseliny, abscisové kyseliny a jasmonové kyseliny v jedné analýze. Pro SPE (extrakce na pevné fázi) byla vyvinuta a optimalizována metoda, založena na hydrofobních/hydrofilních vlastnostech analytů, která umožňuje efektivní odstranění rostlinných barviv z extraktu při zachování vysoké návratnosti cílových látek. Zároveň byla vyvinuta nová separační metoda (UHPLC) ve spojení s detekční metodou (MS/MS) s optimální separací cílových látek a jejich stanovení v MRM módu. SPE-UHPLC-MS/MS metoda byla validována na rostlinném materiálu Arabidopsis thaliana var. Columbia a poprvé využita pro cílené komplexní profilování hladin fytohormonů v koříncích a stoncích čtrnáctidenních A. thaliana po vystavení rostliny salinickému stresu po dobu 48 hodin. V další části práce byla vyvinuta miniaturizovaná metodika pro izolaci a stanovení tRNA-vázaných cytokininů, která byla použita u analýzy mechu Physcomitrella patens a dále také u různých mikrořas a sinic, u kterých bylo studováno jednak spektrum látek z rodiny cytokininů a taktéž poměrné zastoupení volných a tRNA vázaných cytokininů. Dalším předmětem studia bylo provázání výsledků z analýz fytohormonálního profilu metabolitů auxinů a cytokininů obsažených v jednotlivých segmentech stonků rychle rostoucích, bezkořenných, sladkovodních, masožravých rostlin Aldrovanda vesiculosa a Utricularia australis a jejich dormantního stádia (tzv. turionu), s již dříve popsanými fyziologickými aspekty jejich vývoje a životního cyklu (např. rychlý apikální růst, alokace nutrientů, fotosyntéza či senescence). Zde výsledky poukázaly jak na význam detailní analýzy látek z jedné rodiny fytohormonů, tak i na důležitost studia provázanosti různých fytohormonálních skupin a jejich analýzy v širším měřítku. Výsledky mé disertační práce přispívají k zavedení rutinních citlivých metod pro stanovení rostlinných hormonů, umožňujících sledování vzájemných interakcí těchto látek v rostlinách a ke studiu jejich metabolických drah.

Keywords

Rostlinné hormony, Extrakce na pevné fázi (SPE), Ultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie (UHPLC), tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS)

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 8. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Ondřej Novák, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Botanika