NMR Charakterization of Protein - Protein and Protein - Cofactor Interactions

Mgr. Karel Kubíček, PhD.

Doctoral thesis

Anotácia:

Předkládaná práce popisuje nejdříve interakci mezi cytochromem c a cytochromem b5, které utváří modelový komplex pro přenos elektronu. Přestože tento komplex byl již v minulosti podroben zevrubnému zkoumání, nebylo dosud možné jej studovat pozorováním cytochromu c. Dále je v této práci popsána interakce mezi měděným iontem a proteinem DR1885 z Deinococcus radiodurans, který se pravděpodobně podílí na vzniku CuA centra oxidázy cytochromu c. V průběhu mého studia jsem se zabýval především nukleární magnetickou resonancí (NMR), ale současně jsem využil i jiných fyzikálně-chemických metod používaných v moderní strukturní biologii. Stručným popisem těchto technik se zabývá Kapitola 7. Jak jsem již zmínil, interakci mezi cytochromem c a b5 nebylo možné v minulosti studovat pomocí 1H-15N NMR cytochromu c, protože až do nedávna nebylo možné exprimovat aktivní cytochrom c v množstvích, která by umozňovala jeho případné obohacení isotopem dusíku 15N a následné použití v NMR. Samotná interakce byla pozorována sérií 1H-15N HSQC spekter, 15N longitudin ální (R1) a transversální (R2) relaxační rychlosti a dále měřením rychlostí výměny amidů obsažených v proteinové páteři. Z kombinace výsledků získaných z NMR dat a počítačových simulací komplexu vyplývá, že na povrchu negativně nabitého cytochromu b5 jsou až dvě místa, která mohou interagovat s jedním pozitivně nabitým místem cytochromu c. Při nízkých a ekvimolárních koncentracích se utvářejí dva různé adukty v poměru 1:1 cytochrom c : cytochrom b5. Při vysokých koncentracích a při nadbytku cytochromu b5 je tvořen adukt 2:1. Porovnáním našich a již publikovan ých výsledků zjistíme, že struktura aduktu 1:1 se liší v závislosti na původu a primární struktuře cytochromu b5. Protein DR1885 byl zvolen na základě prohlížení bakteriálního genomu, které bylo provedeno s cílem nalézt protein, jenž je svou funkcí ekvivalentní proteinu Cox17. Proteiny Sco1 a Cox17 jsou přídatné proteiny nutné pro vznik eukariotické oxidázy cytochromu c. Na rozdíl od Sco1 se orthology proteinu Cox17 vyskytují jen v eukaryotech. Výsledkem vyhledávání genu se zachovan ým výskytem vedle genu proteinu Sco1 byl protein, který se objevuje v osmi bakteriích a má teoretické vazebné místo s motivem H(M)X10MX21HXM. Následným vyhledáváním pomocí algoritmu BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) bylo nalezeno dalších 42 proteinových sekvencí se stejným vazebn ým motivem. Z těchto 50 proteinů byly vybrány 4, které byly naklonovány a exprimovány. Z důvodu nejlepší reprodukovatelnosti a nejvyšších výtěžků při expresi byl protein DR1885 zvolen ke studiu strukturních a dynamických vlastností. Výsledkem rozsáhlé studie, která zahrnovala metodu EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure) a NMR data, bylo určení struktury apo- i holo-formy s vázaným Cu(I) proteinu DR1885. Závěrem je možné soudit, že DR1885, jako protein se schopností vázat měděný iont, může být zapojen do utváření oxidázy cytochromu c.

Abstract:

The here presented work provides first further information on the interaction between cytochrome c and cytochrome b5 that are forming a model electron transfer complex which has never before been studied from the side of cytochrome c. Secondly, interaction of a copper with protein DR1885 from Deinococcus radiodurans, that is probably involved in the assembly of CuA center of bacterial cytochrome c oxidase is described. The technique mainly used during my Ph. D. training is NMR spectroscopy but other physico-chemical methods utilized in modern structural biology have been applied as well and are briefly described in Chaper 7. Although the interaction of cytochrome b5 and cytochrome c has been intensively studied in the past, the possibility to study the complex formed by these two proteins by 1H-15N NMR of cytochrome c was lacking because, until recently, it was difficult to express the cytochrome c in conditions and yields suitable to label it with 15N. The interaction has been studied through the analysis of 1H-15N HSQC spectra, of 15N longitudinal (R1) and transverse (R2) relaxation rates, and of the solvent exchange rates of protein backbone amides. The analysis of the NMR data was integrated with docking calculations resulting in conclusion that the negatively charged cytochrome b5 has two patches capable of interacting with a single positively charged area of the cytochrome c. At low protein concentrations and in equimolar mixture, two different 1:1 adducts are formed. At high concentration and/or with excess of cytochrome c, a 2:1 adduct is formed. All the species are in fast exchange on the scale of differences in chemical shift. By comparison with literature data, it appears that the structure of one 1:1 adduct changes with the origin or primary sequence of cytochrome b5. The protein DR1885 has been selected after browsing the bacterial genomes with the aim to find a protein functionally equivalent to Cox17. Sco1 and Cox17 are accessory proteins required for the correct assembly of eukaryotic cytochrome c oxidase. At variance with Sco1, Cox17 orthologs are found only in eukaryotes. The search of genes with conserved neighborhood to Sco1 identified, in eight bacteria, a protein having a conserved potential metal binding motif, H(M)X10MX21HXM. A BLAST search then allowed to individuate further 42 conserved sequences having the same metal binding motif. Four sequences belonging to the above protein family were selected, cloned and expressed in a high-throughput approach. Since the His-tag recombinant DR1885 protein from Deinococcus radiodurans showed the highest level of expression, it has been chosen for structural studies - the solution structure of the C-terminal domain in its apo- and Cu(I)-form has been solved. The whole analysis, including extended X-ray absorption fine structure (EXAFS) and NMR data, indicates that DR1885 is a copper protein, possibly involved in the assembly of cytochrome c oxidase.

Keywords

nuclear magnetic resonance, cytochrome, cofactor, titration, structure determination

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 11. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 23. 11. 2007
• Vedúci: prof. RNDr. Vladimír Sklenář, DrSc.
• Oponent: Ing. Marek Kuzma, Ing. Richard Hrabal, CSc., prof. Ing. Antonín Lyčka, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biochemistry (4-years) / Biomolecular Chemistry