Studie kompatibility zárodečných buněk po transplantaci příjemci

MSc. Rigolin NAYAK

Disertační práce

Study on the compatibility of germ cells after transplantation into a recepient

Abstract:

Surrogate production by germline stem cell transplantation is new-age biotechnology to improve aquaculture and basic research pertaining to reproductive biology in fishes. Germ stem cells harvested from the donor at the embryonic or adult stage are transplanted into genetically compatible sterile recipients. The transplanted germ cells are less likely to be rejected by the recipient when the genetic relationship is at the species level. However, the germline chimera production decreases in the case of the phylogenetically distant species. Xenogenic transplantation is often targeted to improve certain traits in the donor species, such as speeding up sexual maturation time, removing the environmental barriers to captive rearing, preserving the genetic resources of threatened species, and boosting gamete production via surrogacy. Germ cell transplantation between those distant species often failed due to less genetic compatibility and other factors, such as the degree of sterility and the stemness of the transplanted germ cell. Another central question about surrogate production concerns the epigenetic changes in donor-derived gametes and progeny, which remain to be unveiled. Epimutations (loss or gain of DNA methylation) are known to cause functional changes that are heritable to many generations. DNA methylation is the best-studied epigenetic mark that regulates gene expression. The germ cells undergo several mechanical and enzymatic treatments during their isolation. Proliferation and differentiation are guided by the host gonadal somatic cells that undoubtedly differ from the donor gonadal microenvironment. Those changes can influence the methylome of the donor germline and, thereby, cause cellular and functional changes that may persist over generations. Xenogenic transplantation was performed between zebrafish and giant danio to increase the amount of zebrafish gametes via giant danio surrogates. The giant danio dead end (dnd) gene was sequenced, and morpholino sequences were designed to deplete germ cell development in giant danio effectively. Spermatogonial transplantation was optimized to produce giant danio germline chimera with ten times more concentrated zebrafish donor-derived sperm than the donor. A similar method can be applied to other species in the future to increase gamete production via a bigger surrogate. A thorough investigation of epimutations and their functional changes was assessed using two kinds of surrogates. The study revealed that the sperm and progeny from both surrogates are genome-wide hypermethylated compared to the donor sperm and progeny. The perturbed hypermethylation did not influence gene expression changes or phenotypical abnormalities confirmed by gene expression analyses and phenotypical investigations. Partial gonadectomy in two small species, zebrafish and killifish, provided an effective method for germ cell isolation without sacrificing the donor, which may apply to other species for surrogate production. The data from the current study will provide greater insight into future germ cell transplantation studies, and the epigenetic comparative studies set the stage for in-depth analysis of donor-derived gametes from phylogenetically distant surrogates and the cryopreserved germ stem cells.

Abstract:

Náhradní produkce pomocí transplantace zárodečných kmenových buněk je novou biotechnologií, která má zefektivnit akvakulturu a základní výzkum týkající se reprodukční biologie ryb. Zárodečné kmenové buňky odebrané dárci v embryonálním nebo dospělém stadiu se transplantují geneticky kompatibilním sterilním příjemcům. U transplantovaných zárodečných buněk je méně pravděpodobné, že budou příjemcem odmítnuty, pokud je genetická příbuznost na úrovni druhu. Produkce zárodečných chimér se však snižuje v případě fylogeneticky vzdálených druhů. Xenogenní transplantace je často zaměřena na zlepšení určitých vlastností dárcovského druhu, jako je zrychlení doby pohlavního dozrávání, odbourání environmentálních překážek při chovu v zajetí, zachování genetických zdrojů ohrožených druhů a zvýšení produkce gamet prostřednictvím náhradního rodičovství. Transplantace zárodečných buněk mezi těmito vzdálenými druhy často selhávala kvůli menší genetické kompatibilitě a dalším faktorům, jako je stupeň sterility a kmenovost transplantovaných zárodečných buněk. Další ústřední otázka týkající se náhradní produkce se týká epigenetických změn v gametách a potomstvu pocházejícím od dárce, které dosud nebyly zkoumány. Je známo, že epimutace (ztráta nebo zisk metylace DNA) způsobují funkční změny, které jsou dědičné pro mnoho generací. Metylace DNA je nejlépe prozkoumanou epigenetickou značkou, která reguluje genovou expresi. Zárodečné buňky jsou během izolace podrobeny několika mechanickým a enzymatickým úpravám. Proliferace a diferenciace se řídí somatickými buňkami hostitelské gonády, které se nepochybně liší od mikroprostředí dárcovské gonády. Tyto změny mohou ovlivnit metylom dárcovské zárodečné linie, a tím způsobit buněčné a funkční změny, které mohou přetrvávat po generace. Byla provedena xenogenní transplantace mezi zebřičkami a daniem malabarským s cílem zvýšit množství gamet zebřiček prostřednictvím náhradních rodičů dania malabarského. Byl sekvenován dean end gen (dnd) dania malabarského a byly navrženy morfolinové sekvence, které účinně znemožňují vývoj zárodečných buněk. Transplantací spermatogonií vznikly zárodečné chiméry dania malabarského produkující spermie zebřičky, které byly desetkrát koncentrovanější než spermie dárce. Podobnou metodu lze v budoucnu použít i u jiných druhů ke zvýšení produkce gamet prostřednictvím většího náhradního rodiče. Pomocí dvou typů náhradních rodičů bylo provedeno podrobné zkoumání epimutací a jejich funkčních změn. Studie odhalila, že spermie a potomstvo obou náhradních rodičů jsou ve srovnání se spermiemi a potomstvem dárce hypermetylované v celém genomu. Porušená hypermetylace neměla vliv na změny genové exprese ani na fenotypové abnormality potvrzené analýzami genové exprese a fenotypovými vyšetřeními. Částečná gonadektomie u dvou malých druhů ryb, zebřiček a halančíků, poskytla účinnou metodu izolace zárodečných buněk bez nutnosti usmrcení dárce, která se může uplatnit i u jiných druhů pro náhradní reprodukci. Údaje z této studie poskytnou lepší vhled do budoucích studií transplantace zárodečných buněk a epigenetické srovnávací studie otevírají prostor pro podrobnou analýzu gamet odvozených od dárce z fylogeneticky vzdálených náhradních spermií a kryokonzervovaných zárodečných kmenových buněk.

Keywords

Náhradní reprodukce, Zárodečné buňky, DNA metylace, Epigenetická remodelace, Transplantace zárodečných buněk, Částečná gonadektomie

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 8. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Ing. Martin Pšenička, Ph.D.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Fakulta rybářství a ochrany vod

Doktorský studijní program / obor:
Zootechnics / Fishery