Použití principu CO-amplifikace při nižší teplotě denaturace (COLD) PCR pro DNA profilování pomocí STR genotypizace

Tereza TICHÁ

Master's thesis

Application of CO-amplification at Lower Denaturation temperature (COLD) PCR principle to DNA profiling by STR genotyping

Abstract:

Mikrosatelity neboli STRs (short tandem repeats), jsou specifické tandemově se opakující krátké segmenty DNA. Mikrosatelity se vyskytují v celém genomu prokaryotických i eukaryotických organismů. Jejich využití je rozsáhlé například v nepřímé diagnostice monogenních chorob, při identifikaci osob nebo vzorků DNA, hledání nových genů a při určování příbuznosti. COLD-PCR (koamplifikace za snížené denaturační teploty) je metoda, která byla vyvinuta pro zvýšení citlivosti detekce a identifikace minoritně zastoupených mutací nebo variant, které mají nižší teplotou tání ve srovnání s Wild-type DNA. Skládá se z pěti základních kroků: denaturace probíhající při vysoké teplotě, hybridizace mutantní alely a Wild-type DNA, denaturace při kritické teplotě (specifické pro každou sekvenci DNA), nasednutí primerů po ochlazení a syntéza komplementární DNA pomocí Taq polymerázy. Pro zvýšení citlivosti metod DNA profilování mikrosatelitů se využívají různé modifikace, které však stejným dílem zvýší signál majoritní i minoritní složky. Někdy je žádoucí zvýšit podíl minoritního profilu ve směsi. Metoda COLD PCR, která využívá nižších teplot ve fázi denaturace DNA dvoušroubovice, je s úspěchem využívána k detekci bodových polymorfismů (SNPs) u onkologických vzorků, ale k vyšetření STRs nebyla prozatím použita.

Abstract:

Microsatellites or STRs (short tandem repeats), specific short tandemly repeated DNA segments. Microsatellites are present in the whole genome of prokaryotic and eukaryotic organisms. Their use is extensive, for example in the indirect diagnosis of monogenic diseases, identification of persons or DNA samples, in the search for new genes or in determining kinship. COLD-PCR (CO-amplification at Lower Denaturation temperature PCR) is a method that has been developed to increase sensitivity of detection and identification of a minority mutations or variants that have a lower melting point in comparison with the Wild-type DNA. It consists of five basic steps: high temperature denaturation, hybridization mutant alleles with Wild-type DNA, denaturation at a critical temperature, which is specific for each of DNA sequence), primer annealing after cooling, and synthesis of complementary DNA using Taq polymerase. To increase the sensitivity methods of DNA profiling by microsatellites are used various modifications, however, there are equally increase the signal majority and minority component. Sometimes is desirable to increase the proportion of minority profile in the mixture. COLD PCR method use the lower temperature phase denaturing the double stranded DNA for successfully used to detect point polymorphisms (SNPs) in cancer samples, but by STRs examination has not been used yet.

Keywords

mikrosatelity, STRs, PCR, COLD-PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 5. 2014

Accessible from:: 7. 5. 2014

Thesis defence

• Supervisor: Doc. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Bioorganic Chemistry