Establishment of proximity labelling approach in Leptomonas seymouri

Adam KRAYZEL

Master's thesis

Abstract:

Leptomonas seymouri je jednohostitelská parazitární trypanosomatida, schopna koinfikovat savčího hostitele, včetně člověka. Koinfekce tímto organismem je možná u imunokompromitovaných pacientů, nejčastěji prostřednictvím Leishmania donovani nebo HIV. Způsob, jakým parazit polokřídlých přežívá v savčím hostiteli, zůstává nejasný a vyžaduje další výzkum. Cílená genová modifikace je užitečným nástrojem pro studium funkcí proteinů a celkové biologie organismů. Jedním z takových nástrojů je metoda Proximity-dependent Biotin Identification (BioID), která umožňuje definovat proteiny nacházející se v těsné blízkosti sledovaného proteinu in vivo. Tato metoda spočívá ve fúzi cílového proteinu s mutovanou formou enzymu biotin ligázy BirA (BirA*), která biotinyluje proteiny v těsné blízkosti. Tento přístup umožňuje studovat interakce sledovaného proteinu s jinými buněčnými složkami. Tato práce se zabývá zavedením BioID přístupu u oportunního parazita Leptomonas seymouri. Jsou zde popsány modifikace pomocí 4-krokové klonovací strategie původního plazmidu pPLOTv1_puro-BirA od Beneke (Beneke et al., 2017) pro potřeby použití v L. seymouri, spolu s endogenním značením genu katalázy pomocí donorové kazety amplifikované z vytvořeného templátu. Gen katalázy L. seymouri představuje další zajímavou záležitost, kterou je třeba prozkoumat. Kataláza rozkládá peroxid vodíku a mohla by být výhodná v oxidačních podmínkách uvnitř savců. Nicméně u dvouhostitelských trypanosomatid byl tento protein druhotně ztracen. Diplomová práce popisuje úspěšnou expresi katalázy fúzované s BirA* in vivo, následnou purifikaci biotinylovaných proteinů a úpravu pull-down podmínek pro eliminaci nespecifických proteinových interakcí.

Abstract:

Leptomonas seymouri is a monoxenous trypanosomatid parasite able to co-infect mammalian hosts, including humans. Co-infection with this organism is possible in immunocompromised patients, most often with Leishmania donovani or HIV. How the hemipteran parasite can survive in a mammalian host stays unclear and requires further investigation. Targeted gene modification is a powerful method to study protein functions and as a result biology of the organism. Proximity-dependent biotin identification (BioID) is an approach to define proteins in close proximity to the protein of interest in vivo. The principal of the method lies in the fusion of the target protein with a mutated form of the biotin ligase enzyme BirA (BirA*) which biotinylates proximal proteins located in close vicinity. By protein tagging, it is possible to study the interaction networks of the protein of interest with other cellular components. My thesis deals with establishing the BioID approach in opportunistic Leptomonas seymouri parasite. Here, the modifications are described by the 4-step cloning strategy of the original plasmid pPLOTv1_puro-BirA from Beneke (Beneke et al., 2017) for the uses in L. seymouri, along with endogenous tagging of catalase gene using the donor cassette amplified from the created template. The catalase gene of L. seymouri represents another intriguing matter needed to be explored. The catalase decomposes hydrogen peroxide and could be advantageous in oxidative conditions inside mammals, however, in two-host trypanosomatids, this protein has been secondarily lost. The thesis describes the successful expression of catalase fusion with BirA* in vivo and the following purification of biotinylated proteins and adjustment of pull-down conditions to eliminate non-specific protein interactions.

Keywords

BirA*, BioID, biotinylace, kataláza, proximity-labeling, Leptomonas seymouri, CRISPR-Cas9

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2023

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 19. 6. 2023
• Supervisor: Ing. Natalia Kraeva, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Experimental Biology