Hodnocení poškození DNA v lidských buňkách pomocí testu mikrojader

Bc. Anna Kalužová

Bachelor's thesis

Evaluation of DNA damage in human cells by micronucleus assay

Abstract:

Na člověka denně působí velké množství chemických látek a jejich směsí, které mohou negativně působit na DNA a tím i na lidské zdraví. Poškození DNA v lidských buňkách může být sledováno pomocí mnoha testů genotoxicity, mimo jiné i prostřednictvím testu mikrojader s využitím cytochalasinu B (CBMN test). Pomocí něho lze stanovovat míru poškození DNA vlivem působení genotoxických látek. Mezi tyto látky můžeme zahrnout i polyaromatické uhlovodíky (PAHs). Hlavním cílem práce bylo zavést tuto metodu do laboratoří Centra pro výzkum toxických látek v prostředí (RECETOX) a optimalizovat automatické vyhodnocení výsledků. Dalším úkolem bylo pomocí této techniky otestovat sadu vzorků náležících do pilotní biomonitorovací studie, zabývající se poškozením DNA v mononukleárních buňkách periferní krve (PBMN) v populaci vlivem reálné expozice PAHs. Metoda CBMN testu je obecně založena na detekci a hodnocení biomarkerů chromozomových zlomů či ztrát celých chromozomů, zvaných mikrojádra (MNi). Ta jsou uložena v cytoplazmě dvoujaderných (BN) buněk, ve kterých byla zastavena cytokineze inhibitorem aktinových mikrofilament, cytochalasinem B (Cyt-B). Tento postup zajišťuje hodnocení pouze těch BN buněk, jež prošly po expozici genotoxinu výhradně jednou karyokinezí. V rámci zavedení byl test aplikován na PBMN buňky izolované a plné krve, a dále byly optimalizovány parametry koncentrace a délky expozice klastogenu mitomycinu C (MMC) a Cyt-B. Pro použití plně automatizovaného systému pro vyhodnocování testu mikrojader byly vytvořeny nové klasifikátory, sety parametrů, jmenovitě například maximální/minimální vzdálenost jader či MNi v buňce, relativní konkavita jader a další, které definují detekované objekty. Výsledky pilotní studie ukázaly, že již první pracovní expozice PAHs může způsobovat dvojnásobné frekvence MNi v PBMN buňkách, tedy poškození DNA, v porovnání se stavem před expozicí. Lze konstatovat, že zavedení CBMN testu do laboratoří RECETOX proběhlo úspěšně, stejně jako jeho vytvoření analytické koncovky prostřednictvím plně automatického zařízení Metafer5. V porovnání s manuální analýzou jsem jakožto největší výhodu automatizovaného CBMN testu identifikovala jeho vysokovýkonný charakter, který omezuje chyby lidského faktoru a urychluje analýzu. Naopak jako největší slabinu lze zmínit jeho časovou limitaci a velkou spotřebu biologického i laboratorního materiálu.

Abstract:

Human is daily exposed to large amount of chemical substances and their mixtures that can negatively influence DNA and human health. DNA damage in human cells can be observed with many genotoxicity tests, besides else with cytokinesis-block micronucleus test (CBMN test). Due to this method, it is possible to assess the extent of DNA damage caused by genotoxic substances. Among these substances can be included also polyaromatic hydrocarbons (PAHs). The main aim of the thesis was to introduce this method to laboratories of Centre for Research of Toxic Compounds in the Environment (RECETOX) and to optimise fully automatic analysis of results. Thereafter, the set of samples belonging to pilot biomonitoring study was tested with this technique. The study was focused on DNA damage in peripheral blood mononuclear (PBMN) cells in the human population as a result of real exposure to PAHs. Method of CBMN test is generally based on detection and evaluation of biomarkers of chromosome breaks or loss of whole chromosomes, called micronuclei (MNi). They are situated in cytoplasms of binucleated (BN) cells, where the cytokinesis was blocked by an inhibitor of actin microfilaments, cytochalasin B (Cyt-B). This procedure ensures the assessment of those BN cells that went only through one karyokinesis after genotoxin exposure. In terms of introduction, the test was applied on isolated PBMN cells and whole-blood PBMN cells, further the parameter of concentration and exposure length of clastogen mitomycin C (MMC) and Cyt-B were optimised. Equally, a new classifier, set of parameters, namely e.g. Maximum/Minimum Distance of Nuclei or MNi within BN cell, Relative Concavity Depth of Nuclei and others, which define detected objects, were introduced. The results of the pilot study revealed that already first occupational exposure of firemen to PAHs can cause double frequencies of MNi in PBMN cells, thus DNA damage, in comparison with the state before exposure. CBMN test was successfully introduced to RECETOX like its analytical termination via fully automated device Metafer5. In comparison with manual analysis, as the biggest advantage of automated CBMN test, its high-throughput character that eliminates mistakes of human factor and fastens analysis, was identified. On the contrary, I see as the weakest point its time limitation and high consumption of biological and laboratory material.

Keywords

genotoxicita, test mikrojader, cytochalasin B, mononukleární buňky periferní krve, polyaromatické uhlovodíky, poškození DNA, pracovní expozice, lidský biomonitoring, genotoxicity, cytokiness-block micronucleus assay, peripheral blood mononuclear cells, polyaromatic hydrocarbons, DNA damage, occupational exposure, human biomonitoring

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 12. 6. 2018
• Supervisor: doc. RNDr. Pavel Čupr, Ph.D.
• Reader: Mgr. Petra Labohá, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry