Molekulární změny vyvolané frakcionovaným ozařováním u lidských nádorových buněk

Bc. Gabriela Rudolfová

Master's thesis

Molecular changes induced in human tumor cells by fractionated irradiation

Abstract:

Cílem této práce bylo sledování molekulárních změn vyvolaných frakcionovaným ozařováním u lidských nádorových buněk. Jako modelový systém byla zvolena buněčná linie MOLT-4 odvozená od lidské T-lymfocytární leukémie. Zaměřili jsme se na srovnání změn v chování buňky po expozici jednorázové a frakcionované dávky záření. Nejprve jsme stanovili dynamiku poklesu viability buněk vlivem rozdílné expozice záření. Podrobnější analýzu indukce apopt?zy při frakcionaci dávky záření jsme zkoumali pomocí flow cytometrických metod za použití duálního značení Annexinem V a propidium jodidem a pomocí analýzy optických parametrů rozptylu světla. Prokázali jsme šetřící efekt frakcionace dávky. Následně jsme studovali změny v množství proteinů významných pro odpověď buňky na ionizující záření, tedy proteinů podílejích se na rozvoji apoptózy a na regulaci buněčného cyklu (p53 a jeho fosforylované formy, aktivovaná Chk2, ?H2A.X, Mcl-1, lamin B). Tyto změny jsme detekovali pomocí elektroforézy a western blotu s následnou imunodetekcí. Dalším krokem byla kvantifikace proteinů pomoci měření integrované optické denzity, která nám poskytla detailnější přehled o množství proteinů v jednotlivých testovaných skupinách buněk. Pro dokreslení představy o procesu v buňkách byla provedena ještě flow cytometrická analýza obsahu DNA v buňce, ve dvou intervalech po ozáření, jež nám poskytla specifičtější pohled o změnách průběhu buněčného cyklu v závislosti naprocesech probíhajících v buňce vlivem záření. Interpretace výsledků je zaměřena na identifikaci rozdílů v buňkách vystavených jednorázové a frakcionované dávce záření. Teoretická část práce charakterizuje ionizující záření a popisuje s tím související, v současné době známé molekulární mechanismy vedoucích k reparačním procesům či indukci apopt?zy na úrovni signálních cest vyvolaných aktivací ATM/ATR kinasy po poškození DNA. Popsány jsou také proteiny, které s těmito buněčnými pochody souvisí.

Abstract:

The aim of the thesis was to observe molecular changes activated by fractionated irradiation of human tumor cells. Cell line MOLT-4, derived from T-lymphocytic leukaemia, was selected as the model system. We focused on the comparison of cell behaviour changes after exposure to ionizing radiation delivered as single dose or fractionated. First, the dynamics of cell viability changes and proliferation caused by different irradiation exposure was defined. We studied in more detailed apoptosis induction by fractionated irradiation using flow-cytometric methods with the application of dual marking by Annexin V and propidium-iodide, and with the help of the analysis of optical parameters of light scattering. A mitigating effect of fractionated irradiation was proved. Subsequently, we researched on the changes in amount of proteins important for the cell's response to ionizing irradiation, that is to say the proteins that participate in the development of apoptosis and the cell cycle regulation (p53 and its phosphorylated forms, activated Chk2, ?H2A.X, Mcl-1, lamin B). These changes were detected using electrophoresis and western blot followed by immunodetection. Next step was the quantification of proteins using integrated optical density measurement, which provided us with a detailed overview of the amount of proteins in individua examined cell groups. To complete the idea of cell processes we also carried out the flow-cytometric analysis of DNA content in a cell in two intervals after irradiation, which offered us a more specific view on changes in the cell cycle depending on processes taking place in a cell under the influence of iradiation. The interpretation of the results is focused on the identification of differences in cells exposed to single and fractionated irradiation dose. The theoretical part of the thesis characterises ionising radiation and describes related, contemporarily known molecular mechanisms leading to repair processes or apoptosis induction on the level of signal pathways triggered by ATM/ATR kinases activation after DNA damage. Proteins related to these cell processes are also described.

Keywords

apopt?za, frakcionované záření, MOLT-4, p53

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 3. 6. 2008
• Supervisor: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

University of Pardubice

Faculty of Chemical Technology

Master programme / field:
Special Chemical and Biological Programmes / Analysis of Biological Materials