Využití cirkulující mRNA pro diagnostiku karcinomu prostaty

Mgr. Jan Balvan, Ph.D.

Advanced ('rigorózní') thesis

Utilization of circulating mRNA for prostate cancer diagnosis

Abstract:

Detekce sérové mRNA poutá v posledních letech značnou pozornost zejména díky jejímu potenciálnímu využití v roli markerů různých onemocnění. Streptavidinem-modifikované paramagnetické mikročástice částice (SMPs) jsou díky jejich možnému automatizovanému použití a vysoké účinnosti zajímavou technikou izolace cirkulujících nukleových kyselin. Cílem této práce bylo optimalizovat protokol izolace mRNA ze séra pacientů s použitím redukovaných objemů reakčních složek a vzorků séra. Byly optimalizovány následující faktory: Množství paramagnetických mikročástic, sondy oligo(dT)20 a séra. Optimalizovali jsme také posloupnost jednotlivých kroků procedury. Měřili jsme množství RNA získané jednotlivými metodami a expresi metalothioneinu 2A, potenciálního nádorového markeru. Zjistili jsme, že izolace RNA je možná z velmi malých objemů séra (10 – 200 μL) bez ovlivnění účinnosti a čistoty. Množství SMPs může být redukováno až na 5 μL s optimální účinností v rozmezí 10 - 30 μL SMPs. Objem sondy oligo(dT)20 neovlivňuje účinnost izolace, neboť byly použity velmi malé objemy bez pozorovaného vlivu na množství a čistotu mRNA. Tento optimalizovaný protokol byl modifikován pro potřeby automatizované „one step“ analýzy probíhající v jedné reakční zkumavce s výslednou účinností identickou ke konvenčnímu postupu. Protokol analýzy „one step“ považujeme za slibné zjednodušení, které dělá izolaci RNA použitelnou pro automatizované procesy.

Abstract:

Determination of serum mRNA gained a lot of attention in recent years, particularly from the perspective of disease markers. Streptavidin-modified paramagnetic particles (SMPs) seem to be an interesting technique, mainly due to possible automated isolation and high efficiency. The aim of this study was to optimize serum isolation protocol to reduce the consumption of chemicals and sample volume. The following factors were optimized: amounts of (i) paramagnetic particles, (ii) oligo(dT)20 probe, (iii) serum, and (iv) the binding sequence (SMPs, oligo(dT)20, serum vs. oligo(dT)20, serum and SMPs). RNA content was measured, and the expression of metallothionein-2A as possible prostate cancer marker was analyzed to demonstrate measurable RNA content with ability for RT-PCR detection. Isolation is possible on serum volume range (10–200 μL) without altering of efficiency or purity. Amount of SMPs can be reduced up to 5 μL, with optimal results within 10–30 μL SMPs. Volume of oligo(dT)20 does not affect efficiency, when used very small volume. This optimized protocol was also modified to fit needs of automated one-step singletube analysis with identical efficiency compared to conventional setup. One-step analysis protocol is considered a promising simplification, making RNA isolation suitable for automatable process.

Keywords

Metallothionein, Mikroseparace, Biomarkery, Paramagnetické mikročástice, Karcinom prostaty, Sérová mRNA, Apoptóza, Izolace RNA, qRT-PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 10. 2013

Thesis defence

• Date of defence: 9. 12. 2013
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Reader: doc. RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D., Mgr. Marie Brázdová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Advanced ('rigorózní řízení') programme / field:
Biochemistry / Biochemistry