Exploring molecular mechanisms underlying genome maintenance and inherited anemia

Mgr. Martin Stojaspal, Ph.D.

Doctoral thesis

Anotácia:

První část práce se věnuje proteinům spojeným s vrozenou dyserytropoetickou anémií typu I (CDA-I). CDA-I je vzácné dědičné onemocnění charakterizované přítomností abnormálních erytroblastů a neefektivní erytropoézou. S CDA-I jsou úzce spojeny proteiny Codanin1 a CDIN1. Codanin1 působí jako regulátor sestavování nukleozomů prostřednictvím interakce s histonovým chaperonem ASF1. Codanin1 přímo interaguje s CDIN1, zatímco úloha CDIN1 není dostatečně popsána. Mutace v Codanin1 a CDIN1 jsou kritické pro progresi CDA-I, avšak účinky mutací souvisejících s CDA-I nemocí na molekulární úrovni nebyly objasněny. Zde rekonstruujeme strukturní obálky CDIN1 a Codanin1, určujeme stechiometrii, definujeme základní interakční oblasti a kvantifikujeme vzájemnou afinitu. Prokázali jsme, že mutace související s anémií narušují vazbu CDIN1 a Codanin1. Naše zjištění představují první data o struktuře Codanin1 a CDIN1 proteinů a naznačující funkční vliv mutací spojených s onemocněním jako další krok v odhalování molekulární etiologie onemocnění CDA-I. Druhá část práce je zaměřena na výzkum proteinů lidského shelterinového komplexu. Při studiu sestavování jádra shelterinového komplexu jsme využili fluorescenční korelační spektroskopie, která na úrovni jednotlivých molekul ukázala, že TRF1 nahrazuje TRF2 z komplexu TRF2-TIN2. Také jsme prokázali, že přítomnost TPP1 umožňuje současnou vazbu obou proteinů TRF1 a TRF2 na TIN2. Navrhli jsme proto model postupného sestavování základních složek shelterinového komplexu. Dále jsme zjistili, že RAP1 není schopen vázat DNA a objasnili tak, že předchozí rozporuplné údaje v literatuře byly způsobeny využitím histidinové kotvy. Kromě toho jsme pozorovali, že RAP1 přímo interaguje s Epc1 a Tip60, čímž zvyšuje histon acetyltransferázovou aktivitu komplexu TIP60/p400. RAP1 také potlačuje totipotentní „2-cell-like“ stav u myších embryonálních kmenových buněk a jeho deplece zvyšuje regulaci mnoha totipotentních genů, což naznačuje, že RAP1 hraje klíčovou roli při přechodu mezi totipotentními a pluripotentními stavy.

Abstract:

The first part of the thesis is dedicated to proteins associated with Congenital dyserythropoietic anemia type I (CDA-I). CDA I is a rare hereditary disease characterized by the presence of abnormal erythroblast and ineffective erythropoiesis. Proteins Codanin1 and CDIN1 are tightly connected with CDA-I. Codanin1 acts as a regulator of nucleosome assembly through the interaction with histone chaperone ASF1. Codanin1 directly interacts with CDIN1, but the role of CDIN1 is poorly understood. Mutations in Codanin1 and CDIN1 are critical for CDA I progression. However, the effects of CDA-I-related mutations at the molecular level have not been elucidated. Here, we reconstruct the structural envelopes of CDIN1 and Codanin1, determine stoichiometry, define essential interacting regions, and quantify mutual affinity. We demonstrate that the anemia-associated mutations disturb CDIN1 and Codanin1 binding. Our findings present new insights into Codanin1 and CDIN1 structure and show the functional effects of disease-associated mutations as the next step in unraveling the molecular etiology of CDA-I disease. The second part of the thesis focuses on shelterin proteins. We studied how the shelterin complex core assembles. We utilized single-molecule fluorescence cross-correlation spectroscopy experiments that showed that TRF1 replaces TRF2 from TRF2-TIN2 complex. Moreover, we noticed that TPP1 allows for the simultaneous binding of TRF1 and TRF2 proteins to TIN2. Thus, we proposed a model for the sequential assembly of the core components of the shelterin complex. Next, we found that RAP1 is unable to bind DNA, and previous contradictory data in literature were caused by his-tag. Additionally, RAP1 directly interacts with Epc1 and Tip60, enhancing the histone acetyltransferase activity of TIP60/p400 complex. RAP1 also suppresses the 2C-like state in mouse embryonic stem cells, and its depletion up-regulates numerous two-cell-like (2C-like) genes, suggesting that RAP1 plays a key role in the transition between two-cell-like and pluripotent states.

Keywords

shelterin, telomera, CDIN1, Codanin1, dyserytropoéza a kongenitální dyserytropoetická anémie, protein-proteinové interakce, telomere, congenital dyserythropoietic anemia, protein-protein interactions

Jazyk práce: English

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 8. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 10. 2023
• Vedúci: doc. Mgr. Ctirad Hofr, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Petr Pečinka, CSc., RNDr. Ondřej Vaněk, PhD., Dr. Valerie Tesmer

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics