Genome analysis in selected representatives of Poaceae

Mgr. Jana ZWYRTKOVÁ

Doctoral thesis

Genome comparative analysis of selected Poaceae representatives

Abstract:

The Thesis aimed to improve the knowledge of genome organization in selected representatives of the family Poaceae. Their genomes were compared, both at the level of genera, species and cultivars. Important results were obtained using advanced molecular biology methods, including flow cytometry and next-generation sequencing. In order to compare repetitively arranged DNA sequences and identify a novel centromeric element in the representatives of the Festuca and Lolium genera, various molecular and genomics approaches were employed. For comparative analyses, sequencing of their genomes by Illumina technology with a small depth of coverage and subsequent in silico analyses of the sequence data were used. The analyses showed that retrotransposons were the most abundant type of repetitive DNA sequences in the genomes of fescues and ryegrasses. The biggest difference in the representation of repetitive sequences between genomes was observed for the Athila element, which belongs to the family of Ty3/gypsy retroelements, when the occurrence of this element in ryegrasses was up to five-fold more frequent than in the fescues. The Ty3/gypsy family includes the Cereba element, which typically localizes to (peri)centromeric chromosome regions, as shown for example in barley or wheat. In this work, the long terminal repeat (LTR) element Fesreba was identified, whose relationship with the Cereba element was confirmed by phylogenetic analysis and further confirmed by colocalization with the histone variant CENH3 in cytogenetic experiments. The location of the Cereba element in the centromeric and pericentromeric chromosome regions suggested a possible role of the Fesreba element in these chromosome domains in the studied grass species. With the aim to facilitate the use of Agropyron cristatum, a wild relative of wheat, in introgressive wheat breeding, highly polymorphic microsatellite (SSR) markers specific for individual chromosomes and chromosome arms of this species were developed. The first step in the experimental procedure was the sorting of chromosomes and chromosome arms by flow cytometry. This approach allowed targeted development of SSR markers. The chromosomal DNA was sequenced by Illumina technology and the data were analyzed using appropriate bioinformatics procedures. This led to in silico identification of 250 SSR markers that were verified using PCR. Out of these, 72 were specific for a particular chromosome, or chromosomal arm. The newly developed SSR markers will enable rapid identification of introduced segments of the A. cristatum genome into the wheat genome and subsequent monitoring of their transfer to future generations during the breeding process. There is an increasing need to understand genome organization and function in important crops, many of them with large genomes. The last part of this work reviewed experimental approaches to facilitate the analysis of complex genomes. The focus was on flow cytometric chromosome sorting and on coupling this technology with the methods of molecular biology and genomics. The successful applications include targeted development of DNA markers, physical mapping, chromosome sequencing, and gene cloning. In summary, the presented Thesis contributed to the improvement of the knowledge on the genome organization in important crops. The results obtained will facilitate the application of molecular and genomic techniques in breeding of new varieties of agricultural crops.

Abstract:

Cílem disertační práce bylo prohloubit znalost struktury genomů vybraných zástupců čeledi Poaceae. Jejich genomy byly porovnávány jak na úrovni rodů, tak na úrovni druhů a kultivarů. Pomocí metod molekulární biologie, včetně průtokové cytometrie a metod sekvenování nové generace, byly získány významné výsledky. Různé molekulární a genomické přístupy byly použity za účelem srovnání zastoupení repetitivně uspořádaných sekvencí DNA a identifikace nového centromerického elementu u zástupců rodů kostřava (Festuca) a jílek (Lolium). Pro komparativní analýzy bylo využito sekvenování jejich genomů technologií Illumina s malou hloubkou pokrytí a následné in silico analýzy sekvenačních dat. Tyto analýzy ukázaly, že retrotranspozóny jsou nejčetnějším typem repetitivních DNA sekvencí v genomech kostřav a jílků. Největší rozdíl v zastoupení repetitivních sekvencí mezi genomy byl pozorován v případě elementu Athila, který patří do rodiny Ty3/gypsy retroelementů, kdy výskyt tohoto elementu u jílků byl až pětkrát četnější než u kostřav. Do rodiny Ty3/gypsy patří Cereba element, který se typicky vyskytuje v (peri)centromerických oblastech, například u ječmene či pšenice. V této práci byla identifikována dlouhá terminální repetice (LTR) element Fesreba, jehož příbuznost s Cereba elementem byla potvrzena fylogenetickou analýzou a také kolokalizací s histonovou variantou CENH3 pomocí cytogenetických experimentů. Výskyt Cereba elementu byl potvrzen v centromerických a pericentromerických oblastech, což naznačuje jeho možnou roli v těchto chromozomálních doménách u studovaných druhů trav. S cílem prohloubit znalosti o potenciálních zdrojích důležitých genů pro introgresní šlechtění pšenice byl studován její planý příbuzný druh Agropyron cristatum. V průběhu disertační práce byly vyvinuty vysoce polymorfní mikrosatelitní (SSR) markery specifické pro jednotlivé chromozómy a ramena chromozómů tohoto druhu. Výchozím experimentálním postupem bylo třídění chromozómů a chromozómových ramen pomocí průtokové cytometrie. Tento přístup umožnil zacílený vývoj SSR markerů. DNA chromozómů byla sekvenována technologií Illumina a data byla zpracována odpovídajícími bioinformatickými postupy. To umožnilo in silico identifikaci 250 SSR markerů, které byly ověřeny pomocí PCR. Z nich 72 bylo specifických pro určitý chromozóm či rameno chromozómu. Nově vyvinuté SSR markery umožní rychlou identifikaci vnesených segmentů genomu A. cristatum do genomu pšenice a sledování jejich přenosu do dalších generací v průběhu šlechtění. S ohledem na rostoucí potřebu znalosti organizace a funkce genomu důležitých zemědělských plodin, které mají obvykle velké genomy, byly v přehledném článku shrnuty experimentální přístupy pro usnadnění jejich studia. Byla popsána kombinace metod třídění chromozómů pomocí průtokové cytometrie a metod molekulární biologie a genomiky. Úspěšné aplikace zahrnují cílený vývoj DNA markerů, fyzické mapování, sekvenování na chromozómové úrovni a klonování genů. Ve svém souhrnu předkládaná disertační práce přispěla k prohloubení znalosti organizace genomů důležitých rostlin a vytvořila předpoklady pro snadnější aplikaci molekulárních a genomických technik ve šlechtění nových odrůd zemědělských plodin.

Keywords

Agropyron cristatum, chromozómová genomika, divocí příbuzní pšenice, Festuca spp., Illumina sekvenování, jednoduché repetice, Lolium spp., repetitivní DNA sekvence

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 1. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Jaroslav Doležel, DrSc.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology