Instrumentation and methods for the pretreatment of biological samples

Mgr. Helena Hrušková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Měřením sloučenin jako jsou proteiny a nukleové kyseliny v biologických matricích lze získat významné informace o stavu našeho organismu. Detekce těchto biomarkerů však může být náročným úkolem. Krev a další tělesné tekutiny obsahují množství různých sloučenin, které se mohou lišit velikostí, koncentrací a dalšími fyzikálně-chemickými vlastnostmi. Pokud analytická technika není dostatečně citlivá a/nebo selektivní pro spolehlivou detekci analytu, je do procesu analýzy nutné zavést předúpravu vzorku. Předložená práce zahrnovala tři projekty, jejichž společným cílem bylo vyvinout účinné, rychlé, levné a jednokrokové preparativní metodiky pro izolaci proteinů a nukleových kyselin z komplexních matric, s potenciálem eliminovat výše uvedené problémy. První projekt se zabýval zakoncentrováním a purifikací proteinů pomocí nově vyvinuté techniky (epitachoforézy) založené na diskontinuálním elektroforéze. Práce zahrnovala vývoj metodiky pro koncentraci a extrakci proteinů v kationtovém módu a její aplikaci na vzorky buněčného média obsahujícího cytochrom c. Druhý projekt byl zaměřen na zdokonalení technologie tekuté biopsie. Pro tyto účely bylo vyvinuto zařízení a metoda umožňující extrakci krátkých cirkulujících nádorových fragmentů nukleových kyselin z krevních vzorků. Metoda byla následně aplikována na různé typy biologických matric. Poslední projekt umožnil rozšíření aplikačního potenciálu zařízení popsaného v předchozím odstavci. Zařízení a nově vyvinutá metoda byly použity pro purifikaci vzorků buněčného média obsahujícího inzulín odebraného z organoidových kultur. Eliminací interferujícího albuminu a větších proteinů ze vzorku došlo k výraznému zlepšení signálu insulinu v následné analýze pomocí kapalinové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií.

Abstract:

Significant information about the state of our organism can be obtained by measurement of compounds such as proteins and nucleic acids. Nevertheless, the detection of these biomarkers in complex biological matrices can be a very challenging task. Blood and other biofluids are very rich in the content of molecules ranging in size, concentration, and other physical-chemical properties. When the analytical technique is not sensitive and/or selective enough to reliably detect the analyte, harnessing appropriate sample preparation is desirable. This work consisted of three main projects aimed to develop efficient, fast, inexpensive, one-step preparative methodologies for the isolation of proteins or DNA from complex matrices alleviating the problems mentioned above. The first project dealt with the concentration and purification of proteins using a newly developed technique (epitachophoresis) based on discontinuous electrophoresis. A new extraction method was introduced in the work and successfully applied to cell medium samples containing cytochrome c. The second project aimed at improving liquid biopsy technology. Therefore, a device and method for the extraction of short tumor nucleic acid fragments were developed. The method was subsequently applied to various types of biological matrices. Finally, the last study extended the applicability of the previously described device. The device and newly developed method were used for the purification of the cell medium collected from organoid cultures containing insulin. The signal of insulin obtained by subsequent analysis was substantially enhanced due to the elimination of interfering albumin and other larger proteins from the sample.

Keywords

sample preparation, biomacromolecules, proteins, DNA, extraction

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2024
• Supervisor: Ing. František Foret, DSc.
• Reader: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D., prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc., RNDr. Mgr. Dušan Koval, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry