Study of a bacterial enzymatic assay for rapid screening of GRETCHEN HAGEN 3 (GH3) family

Bc. Zbyněk BARVÍŘ

Master's thesis

Abstract:

Indole-3-acetic acid (IAA) is one of the most important molecules with biological activity in plants, therefore, its level must be tightly controlled. In plants, various mechanisms occur for regulation of IAA concentration, including conjugation of IAA to amino acids as one of the major inactivation pathways. These conjugation reactions are catalysed by acyl acid amido synthetases of the Group II of the Gretchen Hagen 3 (GH3) family. In this diploma thesis, a recently developed method for characterization of GH3 enzymes has been used to study the activity of one member of this family. This method is based on the heterologous production of a recombinant enzyme from Arabidopsis thaliana in Escherichia coli cells. Bacterial cells are transformed with a protein expression vector in which the Arabidopsis GH3 coding sequence was cloned with an N-terminal 6× His-tag. Recombinant enzyme expression is achieved by incubating these engineered bacterial cultures with isopropyl ß-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) at 20 °C. The presence of the His-tag allows monitoring of recombinant protein production after the induction. The enzymatic reaction is carried out directly in bacteria that produce the recombinant protein. The enzymatic products are analysed by liquid chromatography coupled to tandem spectrometry (LC-MS/MS) using direct injection of a small supernatant fraction from the bacterial culture. Compared to existing in vitro approaches, no purification of the recombinant protein is required, enabling a faster screening of the enzymatic activity. Herein, this method was used to characterize the activity of Arabidopsis GH3.2 enzyme with IAA.

Abstract:

Kyselina indol-3-yloctová (IAA) je v rostlinách jednou z nejdůležitějších biologicky aktivních látek, a proto je její koncentrační hladina přísně regulována. U rostlin se můžeme setkat s různými mechanismy regulace hladiny IAA, z nichž jednou z nejdůležitějších je konjugace s aminokyselinami. Tyto reakce katalyzují enzymy z druhé podrodiny enzymové rodiny Gretchen Hagen 3 (GH3). V rámci této diplomové práce byla nedávno vyvinutá metoda pro charakterizaci enzymů z rodiny GH3 využita pro studium aktivity jednoho z jejích členů. Tato metoda je založená na heterologní produkci enzymu z huseníčku rolního v buňkách Escherichia coli. Hostitelské buňky jsou transformovány vektorem s vneseným genem vybraného GH3 enzymu. Exprese tohoto genu je dosaženo pomocí isopropyl-ß-D-thiogalaktopyranosidu (IPTG) při 20 °C. Přítomnost histidinové značky umožňuje sledování produkce rekombinantního proteinu po indukci. Enzymatická reakce probíhá přímo v transformovaných bakteriích. Produkty enzymové reakce jsou stanoveny přímým nástřikem supernatantu bakteriální kultury pomocí kapalinové chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Oproti dříve používaným in vitro přístupům není v tomto případě nutná izolace rekombinantního proteinu. V této práci byla metoda použita pro charakterizaci enzymu GH3.2 z huseníčku rolního.

Keywords

IAA, Gretchen Hagen 3, GH3.2, rekombinantní enzym, kapalinová chromatografie, tandemová hmotnostní spektrometrie

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Ondřej Novák, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry