Balancování endogenního a exogenního FGF2 signálování u lidských pluripotentních kmenových buněk

Mgr. Žaneta Konečná, Ph.D.

Doctoral thesis

Balancing endogenous and exogenous FGF2 signaling in human pluripotent stem cells

Abstract:

Lidské pluripotentní kmenové buňky (PSCs) mohou být téměř neomezeně propagovány v nediferencovaném stavu, pokud jsou během dlouhodobé kultivace udržovány v podmínkách podporujících jejich kmenovost. Z tohoto důvodu jsou do kultivačních médií pro lidské PSCs přidávány různé růstové faktory, včetně rekombinantního fibroblastového růstového faktoru 2 (FGF2), který je považován za nejdůležitější. I přes každodenní výměnu kultivačního média hladiny a biologická aktivita FGF2 výrazně fluktuují, což je způsobeno jeho termální nestabilitou. Kromě exogenního FGF2 má v udržování kmenovosti lidských PSCs nezastupitelnou roli také endogenní FGF2, jehož nízkomolekulární (LMM) izoforma je sekretována do extracelulárního prostoru, kde pravděpodobně zahajuje své autokrinní/parakrinní signálování. Ačkoliv je úloha FGF2 signálování v udržování kmenových vlastností lidských PSCs relativně dobře prostudovaná, vzájemná spolupráce endogenního a exogenního FGF2 nebyla dosud zcela objasněna. V první části mé dizertační práce jsem studovala mechanizmus sekrece LMM FGF2 v lidských PSCs v souvislosti s prokázáním existence autokrinní/parakrinní signální smyčky, jejíž následná manipulace by mohla být využita v buněčném inženýrství pro vylepšení diferenciačních protokolů vyžadujících inhibici FGF2 signálování. Tohoto by mohlo být dosaženo například inhibicí funkce molekul nezbytných pro FGF2 sekreci. Zjistila jsem, že tyrozin kináza exprimovaná v hepatocelulárním karcinomu, TEC, interaguje s FGF2, což vede k jeho fosforylaci na tyrozinu 82 a jeho následné sekreci z lidských PSCs. Snížení exprese TEC vedlo k inhibici FGF2 sekrece a narušení sebeobnovy lidských PSCs. Tyto výsledky potvrdily funkci TEC v sekreci LMM FGF2 a také přinesly další důkaz o existenci autokrinní/parakrinní signální smyčky FGF2 u lidských PSCs. V druhé části mé práce jsem testovala, zda termální stabilizace exogenního FGF2 bude mít pozitivní vliv na zachování kmenovosti lidských PSCs. V tomto případě se ukázalo, že termální stabilizace vede k prodloužení biologické aktivity FGF2, což následně pozitivně ovlivňuje proliferaci a sebeobnovu lidských PSCs. Termální stabilizace FGF2 dále umožnila snížení frekvence výměn kultivačního média u lidských PSCs z jednoho na čtyři dny.

Abstract:

Human pluripotent stem cells (PSCs) could be almost indefinitely propagated in undifferentiated state during prolonged cultivation if maintained in stemness supporting niche. To achieve this condition, various growth factors are commonly added into the culture media for human PSCs including recombinant fibroblast growth factor 2 (FGF2) that is considered to be the most important one. Although culture medium is changed daily, FGF2 levels and activity significantly fluctuate due to its thermal instability. Beside exogenously added FGF2, endogenous FGF2 has also an indispensable role in the maintaining of human PSCs stemness as its low molecular mass isoform (LMM) is known to be secreted to the extracellular space where it is predicted to act in autocrine/paracrine manner. Though the role of FGF2 signaling in human PSCs stemness maintaining is relatively well-studied, the mutual cooperation of endogenous and exogenous FGF2 has not been fully elucidated. In the first part of my thesis, I studied mechanisms of FGF2 secretion and its biological function in order to demonstrate the existence of its autocrine/paracrine loop that could be later manipulated in the stem cells engineering to improve specific differentiation requiring inhibited FGF2 signaling, for instance by the inhibition of molecules crucial for efficient FGF2 secretion leading to FGF2 signaling downregulation. Here tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma, TEC, was found to interact with FGF2, leading to FGF2 phosphorylation at tyrosine 82 and its subsequent secretion. Downregulation of TEC expression inhibited FGF2 secretion, and compromised human PSCs self-renewal. These results confirmed TEC function in LMM FGF2 secretion, and also brought additional evidence about the existence of an autocrine/paracrine FGF2 signaling loop in human PSCs. In the second part of my thesis, I tested whether thermal stabilization of exogenous FGF2 will improve maintaining of human PSCs stemness. In this case, thermal stabilization of FGF2 molecule prolonged FGF2 biological activity leading to improved human PSCs proliferation and self-renewal. Furthermore, thermal stabilization of FGF2 reduced the frequency of human PSCs media change from one to four days, improving cost- and time-efficiency of the culture protocol.

Keywords

Lidské PSCs, Human PSCs, TEC, FGF2, sekrece, secretion, termální stabilizace, thermal stabilization, kmenovost, stemness

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 8. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 20. 9. 2018
• Supervisor: prof. Ing. Petr Dvořák, CSc.
• Reader: Ellen Margrethe Haugsten, Miriama Krutá

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Biology (4-years) / Medical Biology