Analýza mechanismu sestřihu RNA v netypických sestřihových místech

Mgr. Michal Kramárek, Ph.D.

Doctoral thesis

RNA splicing of exons with atypical splice sites

Abstract:

Alternativní sestřih pre-mRNA je důležitým rysem exprese lidských genů, který významně rozšiřuje počet isoforem v transkriptomu a proteomu. Alternativní sestřih je umožněn relativně degenerovanými motivy místa sestřihu na obou koncích intronu. Správné rozpoznání 5' sestřihových míst (5'ss) je ovlivněno jejich sekvenčními motivy a je rozhodující pro definici intronu. Některé atypické 5'ss se však významně liší od konsenzuálního motivu 5'ss, což vyvolává otázku, jak jsou spliceosomem rozpoznány. Jedno takové atypické tandemové 5'ss obsahuje exon 21 genu STAT3, kde dvě překrývající se 5'ss vytvářejí sekvenční motiv, který je vysoce nepříznivý pro rozpoznání “druhého” (D2) 5'ss. Navzdory tomu se přednostně používá právě toto 5'ss. Disertační práce se zaměřila na objasnění molekulárního mechanismu, jak je toto tandemové 5'ss využíváno. Za tímto účelem byla použita analýza sestřihu v minigenovém systému v kombinaci s expresí umělých U1/U6 snRNA. Poskytuji důkaz, že endogenní U1 snRNA se váže pouze na jedno ze dvou 5'ss a že využití D2 5'ss je umožněno dvěmi specifickými RNA-RNA interakcemi s U6 snRNA. Za prvé, byla prokázána participace nového nekanonického vazebného registru mezi U6 snRNA a D2 5'ss a za druhé, využití D2 5'ss je umožněno blízkým regulačním elementem, který pravděpodobně tvoří RNA duplex stabilizovaný Watson-Crickovým párováním s U6 snRNA. Tato práce odhaluje nový způsob rozpoznávání 5'ss pomocí U6 snRNA, což naznačuje, že interakce U6:5'ss je mnohem flexibilnější, než se dříve myslelo.

Abstract:

Alternative pre-mRNA splicing is an important feature of human gene expression that significantly expands the number of isoforms in the transcriptome and proteome. The alternative splicing is enabled by relatively degenerate splice site motifs at both ends of the intron. Proper recognition of 5' splice sites (5'ss) is influenced by their sequence motifs and is critical to the definition of an intron by the spliceosome. However, some atypical 5'ss significantly differ from the 5'ss consensus motif raising the question of how they are effectively recognized by the spliceosome. One such atypical tandem 5'ss is located in STAT3 exon 21 where two overlapping 5'ss create an unusual sequence motif which is highly unfavourable for the recognition of the downstream (D2) 5'ss. Despite this, the D2 5'ss is used preferentially. This thesis focused on elucidating the molecular mechanism by which this tandem 5'ss is effectively utilized. To this end, high-throughput mutagenesis in a minigene context and overexpression of artificial snRNAs were used. I provide evidence that the endogenous U1 snRNA binds only to one of the two 5'ss and that the usage of the D2 5'ss is enabled by two novel interactions with U6 snRNA. Firstly, I provide functional evidence of a novel non canonical binding register between U6 snRNA and the D2 5'ss. Secondly, the D2 5'ss usage is enabled by the downstream regulatory element which probably establishes Watson-crick base pairing with U6 snRNA. This work uncovers a novel mechanism of 5'ss recognition by U6 snRNA which suggests that the U6:5'ss interaction is much more flexible than previously thought.

Keywords

pre-mRNA splicing, spliceosome, U1, U6 snRNA, STAT3, tandem splice sites, atypical 5'ss, minigene, high-throughput, RNA sequencing

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 11. 6. 2024
• Supervisor: Mgr. Přemysl Souček, Ph.D.
• Reader: prof. Mgr. David Staněk, Ph.D., prof. Mgr. Štěpánka Vaňáčová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics