Klonování, exprese a charakterizace lektinů z Burkholderia cenocepacia

Mgr. Margita Sláviková

Diplomová práce

Anotace:

Cystická fibróza je autosomáln recesivní onemocnní zpsobené mutací genu CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), je doprovázeno širokým spektrem klinických píznak, zejména však nedostatenou funkcí enzym slinivky bišní a plicními infekcemi [1]. Mezi nejastjší patogeny, které kolonizují plíce pacient s cystickou fibrózou patí Pseudomonas aeruginosa [2] výjimená svou adaptabilitou, pirozenou rezistencí k dezinfekním látkám a antibiotikm [3]. Virulence P. aeruginosa je sdružena se schopností adherovat k bukám hostitele, vytváením biofilmu, produkcí hydrolytických enzym a toxických látek. Produkuje dva lektiny PA-IL a PA-IIL spolen s ostatními sekundárními virulentními faktory. Lektiny P. aeruginosa jsou specifické pro galaktosu (PAI-L) a fukosu (PAII-L). Jedná se o první na vápníku závislé bakteriální lektiny (vazba k cukru je realizována pes ionty vápníku), které byly strukturn charakterizovány. Oba lektiny jsou schopny se specificky se vázat ke glykanm a jsou multivalentní. Vtšina jejich aktivity byla detegována intracelulárn, akoliv jistá ást je lokalizována na cytoplazmatické membrán. PA-IIL je pítomen ve velkém množství práv na vnjší stran bakteriální membrány [4]. Lektin PA-IIL je prokázaným virulentním faktorem - tato skutenost vedla k prohledavání databází a hledání analog tohoto proteinu. Podailo se je nalézt u Burkholderia cenocepacia, druhým nejastjším, avšak více obávaným mikroorganizmem napadajícím práv jedince s cystickou fibrózou. Zpsobuje infekce plic rzné závažnosti, které mohou vyústit až v tzv. Cepacia syndrom, který vede k astým úmrtím pacient s cystickou fibrózou[5]. Píprava a charakterizace rekombinantních protein z Burkholderia cenocepacia mže napomoct k objasnní jejich funkce v procesu, kdy dochází k infekci B. cenocepacia, jedná-li se též možné virulentní faktory. Využití tchto poznatk pak mže pomoct ovlivnit lébu pacient s cystickou fibrózou.

Abstract:

Burkholderia cenocepacia is a Gram negative bacterium, which is ubiquitous in the environment and may cause a number of diseases in plants (rot of onion). Human infection can be caused by B. cepacia in imunocompromised patients, especially in patients with cystic fibrosis. Cystic fibrosis is caused by mutations in the gene encoding the cystic fibrose transmembrane conductance regulator (CFTR), which acts as a chloride channel. A subset of cystic fibrosis (CF) patients infected with B. cepacia succumb to the ,,cepacia syndrome a rapidl fatal bacteremic illness; this is quite distinct from the sort of infections caused by the more common CF pathogen Pseudomonas aeruginosa. Bacterium P. aeruginosa is an opportunistic pathogen that can infect almost every human tissue when immunity barriers are lowered. Chronic lung colonization by the bacterium is the major cause of morbidity and mortality. The mutations of the CFTR, which alter ion movements, also affect the N-glycosylation of CFTR, as well as that of the other cell surface glycoconjugates. The net effect is increased fucosylation, decreased sialylation and specific binding to P. aeruginosa. In addition, CF patients display modification in their respiratory and salivary mucin with a higher percentage of sialylated and sulfated Lewis X oligosaccharides, which are binding sites for P. aeruginosa via fimbrial and flagellar adhesion or non-pili lectines. The identification of molecules involved in this pathogen, and the specific recognition of the modified host cell components is therefore of therapeutic value. P. aeruginosa produces hight levels of D-galactose and L-fucose binding lectins, PA-IL and PAII-L. PA-IIL was already proved to be a virulent factor. There were searched the databases of genomes in order to find sequentional homologues of PA-IIL. There were found three homologues of PA-IIL in the Burkholderia spp. of bacteria these proteins were named BCA-L, BCB-L and BCC-L. The major aim of my thesis was to characterize some of the PA-IIL homologues in Burkholderia cenocepacia were amplified from genomic DNA of B. cenocepacia from (BCA and BCB genes). DNA fragments were subsequently cloned into an expression vector and thus, an expression system has been developed. Moreover, an optimization process of the BCA-L lectin purification via FPLC was successfully developed and tested. There were made several structural-functional characterization experiments, in order to gain more complete information about the protein, e.g. microarray analysis and isothermal titration calorimetry measurements. From the above mentioned, it was proven that BCA-L displays a high affinity towards D-mannose and its mannosylated oligosacharides. This may be assigned to the fact that likewise the RS-IIL the homologue from Ralstonia solanacearum. BCA-L contains alanine at position 22 in binding site in contrary to serine in fucose preferring lectins PA-IIL from P. aeruginosa and CV-IIL from Chromobacterium violaceum, respectilvely.

Klíčová slova

lektin, cystická fibroza, BCA-L

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 23. 5. 2006
• Vedoucí: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Chemie / Biochemie