Studium molekulárních mechanismů účinku vybraných steroidů v nádorových buňkách

Mgr. Petr VOŇKA

Disertační práce

Molecular mechanisms of action of selected steroids in cancer cells

Anotace:

Estrogenový receptor alfa (ER) je klíčovým biomarkerem karcinomu prsu, který v případě hormonálně závislých karcinomů ovlivňuje jak léčebné režimy, tak prognózu pacientů. ER je aktivován vazbou ligandu, kterým je nejčastěji steroidní molekula estradiol. Steroidy představují skupinu sloučenin, jejichž struktura obsahuje čtyřkruhový steranový skelet. Unikátní knihovna steroidních látek byla prohledána pomocí dokování s cílem nalézt nové potenciální ligandy pro ER, které mohou mít protirakovinné vlastnosti. Účinek vybraných sloučenin na aktivitu ER byl in vitro stanoven luciferasovým reportérovým testem, který byl za tímto účelem vyvinut. Hlavně dvě sloučeniny, MU-5562 a MU-5611, snižovaly aktivitu ER srovnatelně s klinicky používanými ER inhibitory, jako je tamoxifen či fulvestrant. Inhibiční účinek MU-5562 a MU-5611 na ER je pravděpodobně způsoben jejich společným strukturním prvkem, kterým je dvojná vazba v D kruhu. Posléze analýza westernovým přenosem odhalila, že MU-5611 snižuje u buněk MCF7 hladinu nejen ER jako cílového proteinu, ale také progesteronového receptoru jehož exprese je přímo regulována ER. Kromě inhibice ER byla také po aplikaci MU-5611 detekována změna energetického stavu mitochondrií jak u buněk MCF7, tak u buněk MDA-MB-231. Dosažené výsledky tedy ukazují, že aplikace MU-5611 vede k indukci apoptózy nezávisle na inhibici ER, což bylo potvrzeno mimo jiné i stanovením Annexinu V pomocí průtokové cytometrie. Dosažené výsledky dokazují, že zvolená kombinace výpočetních a experimentálních metod představuje dostatečně robustní přístup umožňující identifikaci potenciálně zajímavých sloučenin, v tomto případě se jednalo o látku MU-5611, která vykazuje dvojí mechanismus protinádorového účinku v buňkách odvozených od karcinomu prsu.

Abstract:

Estrogen receptor alpha (ER) is a key breast cancer biomarker that affects both treatment regimens and patient prognosis in the case of hormone-dependent cancers. ER is activated by the binding of a ligand, which is most often the steroid molecule estradiol. Steroids represent a group of compounds whose structure contains a four-ring sterane skeleton. A unique library of steroid compounds was screened by docking to find new potential ligands for ER that may show anticancer properties. The effect of selected compounds on ER activity was determined in vitro by a luciferase reporter assay developed for this purpose. Mainly two compounds, MU-5562 and MU-5611, reduced ER activity comparable to clinically used ER inhibitors such as tamoxifen or fulvestrant. The inhibitory effect of MU-5562 and MU-5611 on ER is likely due to their common structural feature, which is a double bond in their D-ring. Later, western blot analysis revealed that MU-5611 downregulates both ER as a target protein and progesterone receptor as an ER-regulated gene product in MCF7 cells. In addition to the inhibition of ER, a change in the energy state of mitochondria was also detected after the application of MU-5611 using JC-1 staining in both MCF7 cells and MDA-MB-231 cells. The results obtained therefore show that treatment with MU-5611 leads to the apoptosis of the tested cells, which was determined by staining with Annexin V. In conclusion, our data indicates that the selected combination of computational and experimental methods is sufficient to identify the compunds of interest, in our case MU-5611, which showed dual mechanisms of anticancer activity in cells derived from breast cancer.

Klíčová slova

Estrogenový receptor alfa, knihovna steroidních látek, luciferasový test, mitochondrie, apoptóza, karcinom prsu

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 6. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D., doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie