Příprava externí kontroly pro detekční systémy založené na reverzně transkripční real time PCR

Mgr. Pavel Mikel, Ph.D.

Doctoral thesis

Preparation of external controls for detection systems based on reverse transcription real time PCR

Anotácia:

Viry způsobující infekce z potravin představují heterogenní skupinu patogenních agens, které jsou příčinou infekčních onemocnění postihujících člověka. Z evropského i světového hlediska mají z této skupiny virových agens největší dopad na zdraví lidí noroviry (NoV), virus hepatitidy A (HAV) a virus hepatitidy E (HEV), jejichž genom je tvořen jednořetězcovou RNA s pozitivní polaritou (+ssRNA). V současnosti je naprostá většina metod pro průkaz virů v potravinách založena na uvolnění virových částic ze vzorku, jejich zakoncentrování, izolaci virové nukleové kyseliny a její detekci a případně kvantifikaci. K samotné detekci a kvantifikaci se využívají moderní molekulárně biologické metody, z nichž především kvantitativní reverzně transkripční polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RT-qPCR) nachází za tímto účelem nejčastější uplatnění. Předmětem disertační práce je příprava univerzální externí kontroly analýzy vzorků potravin na přítomnost virů způsobujících infekce z potravin s využitím metody RT-qPCR, která je rutinně využívána pracovní skupinou Virologie potravin na oddělení Bezpečnosti potravin a krmiv ve Výzkumném ústavu veterinárního lékařství, v.v.i. Detekce a kvantifikace těchto virů ve vyšetřovaných vzorcích představuje u potravinových matric poměrně složitou, vícekrokovou analýzu. Proto je nezbytně nutné striktně kontrolovat celý proces analýzy, aby bylo možné identifikovat falešně negativní výsledky detekce a zaručit platnost a spolehlivost výsledků analýzy. Externí kontrola analýzy byla připravena formou uměle konstruovaných MS2 fágům podobných částic (MS2 PLP – MS2 phage-like particles), které jsou odvozené od bakteriofága MS2. Připravené MS2 PLP nesou uvnitř kapsidy unikátní kontrolní sekvenci, jejíž přirozený výskyt je ve vyšetřovaném vzorku krajně nepravděpodobný a je tedy možné je využít jako univerzální externí kontrolu analýzy pro všechny využívané RT-qPCR systémy. Byly zavedeny metody produkce, purifikace, testování stability a kvantifikace připravených částic a MS2 PLP byly využity k přesnému stanovení účinnosti analytického procesu u různých druhů matric. Druhá část práce se zabývá zdokonalením metody přípravy MS2 PLP se zaměřením na jejich purifikaci. Byla vyvinuta metoda, která umožňuje relativně rychlou a jednoduchou přípravu vysoce kvalitních MS2 PLP. Tento přístup přibližuje tuto technologii jejímu širšímu využití. Třetí část práce se zabývá uplatněním získaných poznatků v praktickém využití formou publikovaných článků, uplatněných certifikovaných metodik, prototypů a užitných vzorů.

Abstract:

The food-borne viruses are the heterogeneous group of pathogenic agents causing infectious diseases affecting humans. From the European and world point of view, noroviruses (NoV), hepatitis A virus (HAV) and hepatitis E virus (HEV), whose genomes consist of positive-sense single-stranded RNA (+ssRNA), have the greatest impact on human health. Currently, the majority of the methods for detecting food-borne viruses is based on the release of viral particles from the sample, their concentration, the isolation of viral nucleic acid and its detection and quantification. The advanced methods of molecular biology are used for the detection and quantification of food-borne viruses, of which the real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR) is the most frequent use for this purpose. The dissertation is focused on the preparation of a universal external control of the analysis of food samples for the presence of food-borne viruses using RT-qPCR, which is routinely used by Food virology unit in the Department of Food and Feed Safety in the Veterinary Research Institute. The detection and quantification of food-borne viruses in food matrices represents a relatively complex, multi-step analysis. Therefore, it is necessary to strictly control the entire process of analysis in order to identify false negative results and to guarantee the validity and reliability of the results. The external control of analysis was prepared in the form of MS2 phage-like particles (MS2 PLP), which are derived from bacteriophage MS2. The prepared MS2 PLP carry a unique control sequence within the capsid whose natural occurrence in the analyzed sample is extremely unlikely and can therefore be used as a universal external control of analysis for all used RT-qPCR systems. Methods of production, purification, stability testing and quantification have been introduced, and MS2 PLP were used to accurately determine the efficiency of the analytical process for different types of matrices. The second part of the dissertation deals with the improvement of the MS2 PLP preparation method focusing on their purification. A method that allows a relatively quick and simple preparation of high quality MS2 PLP has been developed. This approach makes it possible to open this technology available to its wider use. The third part of the dissertation is focused on application of acquired knowledge in practical use in the form of the published articles, applied certified methodologies, prototypes and utility models.

Kľúčové slová

viry způsobující infekce z potravin, externí kontrola analýzy, potraciny, fágům podobné částice, bakteriofág MS2, food-borne viruses, external control of analysis, foodstuffs, phage-like particles, bacteriophage MS2

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 1. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 2. 3. 2018
• Vedúci: Mgr. Petr Králík, Ph.D.
• Oponent: prof. RNDr. Aleš Knoll, PhD., Mgr. Ivana Mašlaňová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology