Antioxidační mechanismy v prevenci oxidativního poškození

Mgr. Daniela Komrsková, Ph.D.

Disertační práce

Antioxidative mechanism in prevention of oxidative injury

Anotace:

Tvorba reaktivních metabolitů (RM) a antioxidantů je nezbytnou funkcí společnou pro všechny aerobní buňky. Za fyziologických podmínek je tvorba RM a antioxidantů v rovnováze a RM vykonávají svou fyziologickou funkci. V případě nadprodukce RM, nebo nedostatečné kapacity antioxidačního obranného systému dochází k porušení této rovnováhy a ke vzniku tzv. oxidativního stresu. Oxidativní stres je spojen s celou řadou onemocnění jako je ateroskleróza, kardiovaskulární a nádorová onemocnění, katarakt, imunologická onemocnění, diabetes mellitus apod. Antioxidanty jsou tudíž zkoumány z hlediska možné prevence a terapie těchto chorob. Chemiluminiscenční (CL) metody jsou pro svou jednoduchost, citlivost a rychlost běžně používané pro měření produkce RM a antioxidačních vlastností řady látek. Při CL měření se využívá reakce luminoforu (např. luminol, lucigenin apod.) s látkou radikálové povahy. Zkoumají se přímé vychytávací účinky vůči RM, jejich působení jako inhibitorů některých reakcí vedoucích ke tvorbě těchto RM, popřípadě jejich chelatační účinky vůči iontům přechodných kovů. Cílem první části práce bylo optimalizovat složení chemických systémů používaných pro produkci reaktivních metabolitů kyslíku (RMK) v laboratorních podmínkách a pomocí selektivních specifických vychytávačů určit, které RMK jsou těmito systémy produkovány. K detekci produkce RMK byla použita CL metoda a získané výsledky byly porovnány s výsledky získanými pomocí elektronové spinové (ESR) spektroskopie. Výsledkem tohoto měření je zjištění, že použité chemické systémy produkují směs RMK založenou na produkci .OH, nikoli jednotlivé RMK. Použité chemické systémy přesto podávají rozdílné informace o antioxidačním působení látek a v případě opatrné interpretace výsledků je lze používat pro hodnocení antioxidačních vlastností látek v laboratorních podmínkách. Cílem druhé části práce bylo určit podíl KA na antioxidační kapacitě krevní plazmy a séra a dále učit vůči kterým RMK působí KA antioxidačně. Vliv zvyšující se koncentrace KA na celkovou antioxidační kapacitu krevní plazmy a séra byl zkoumán CL metodou zvanou TRAP (Total peroxyl Radical-trapping Antioxidative Parameter). Peroxylové radikály (ROO.) byly produkovány v konstantním množství termální dekompozicí sloučeniny 2,2`-azo-bis(2-amidinopropan) hydrochloridu (ABAP). Jako standart byl použit ve vodě rozpustný analog alfa-tokoferolu, TROLOX. Výsledkem tohoto měření je zištění, že KA se chová jako antioxidant, ale i prooxidant. Její antioxidační působení spočívá v jejím spolupůsobení s ostatními složkami krevní plazmy (kyselina močová, vitamin E, -SH skupiny) na zvyšování celkové antioxidační kapacity krevní plazmy a vychytávání RMK. Jako prooxidant se chová redukováním iontů přechodných kovů, čímž umožňuje jejich reakci s H2O2 za vzniku .OH.

Abstract:

Production of reactive species (RS) and antioxidants is an essential function common for all aerobic cells. At physiological conditions production of RS and antioxidants is in balance and RS carry out their physiological function. The overproduction of RS or inadequate capacity of the antioxidant defence system lead to the imbalance between the reactive species (RS) production and function of antioxidative defence system and to the oxidative stress. Oxidative stress is connected with many diseases like atherosclerosis, cardiovascular and tumour diseases, cataract, immunological diseases, diabetes mellitus etc. Antioxidants are then investigated to use them in prevention or therapy of the diseases. Chemiluminescence (CL) methods are for their simplicity, sensitivity and quickness commonly used methods for measurement of RS production and antioxidative properties of various substances. Reaction of a luminophor (i.e. luminol, lucigenin etc.) with a radical is used in the CL measurements. Direct scavenging capacity of samples, their function as inhibitors of several reactions leading to the RS production or their function as free metal ions chelators was examined. The first part of the thesis was designed to optimise chemical systems for production of individual ROS other than peroxyl radicals with the intention of using them as a new tool for evaluating the antioxidative properties of various materials in laboratory conditions and by using selective specific scavengers to find out which ROS are produced in the systems. CL method was used and the results were compared with results obtained from electron spin resonance (ESR) spectroscopy measurements. It can be seen that none of the systems studied in these experiments generated a single free radical, but rather a complex of different reactive oxygen species that are all based on the .OH production. In spite of this chemical systems used in this experiment furnish different information about antioxidant behaviour of substances. The aim of the second part was to determine how AA influences blood plasma and serum antioxidant capacity and which ROS are scavenged or their production is inhibited by AA. The influence of increasing concentration of AA on the total antioxidant capacity of blood plasma and serum was measured using the TRAP (Total peroxyl Radical-trapping Antioxidative Parameter) method. Peroxyl radicals were produced at a constant rate by thermal decomposition of water-soluble ABAP. TROLOX, a water-soluble analogue of alfa-tocopherol, was used as a standard. From the results follows that AA acts both as an antioxidant but also a prooxidant. It acts as an antioxidant by creating antioxidative capacity with other components of the blood plasma and by scavenging ROS. Its prooxidant behaviour lies in reduction of metal ions and thus enables production of .OH.

Klíčová slova

reaktivní metabolity, antioxidanty, chemiluminiscence, oxidativní stres, reactive species, antioxidants, chemiluminescence, oxidative stress

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 12. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 12. 2006
• Vedoucí: RNDr. Milan Číž, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie / Fyziologie živočichů