Hledání interakčních partnerů cytoskeletálního proteinu EB1c a jeho lokalizační analýza s využitím moderních mikroskopických technik

Bc. Kateřina PERNIČKOVÁ

Diplomová práce

The search for interaction partners of the cytoskeletal EB1c protein and its localization analyses with the help of the modern microscopic techniques

Anotace:

Cytoskelet je významnou částí eukaryotní buňky hraje roli v buněčném dělení, transportu organel a makromolekul nebo v odpovědi na vnější podněty. V plnění jeho funkcí mu napomáhá také velké množství interagujících proteinů, mezi nimi i EB1c, jehož bližší charakteristika je hlavním předmětem této diplomové práce. Jako modelový organismus byla použita rostlina Arabidopsis thaliana. Pomocí metody bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) byly testovány potenciální interaktory proteinu EB1c určené na základě předchozích in silico studií. Výsledky mikroskopických studií agroinfiltrovaných listů tabáku ukázaly pravděpodobnou interakci s některými z nich. Za účelem potvrzení interakce byla připravena polyklonální anti-EB1c protilátka proti C-terminálnímu peptidu proteinu. Tato protilátka však při imunoprecipitační analýze a "whole-mount" barvení nedetekovala protein EB1c. Za účelem studia pohybu proteinu EB1c z jádra a do jádra byly rostliny Arabidopsis exprimující EB1c-GFP pod nativním promotorem kříženy s rostlinami exprimujícími fluorescenčně značený jaderný marker. Rovněž byly tyto rostliny spolu s rostlinami Col-0 a rostlinami exprimujícími EB1c-Dronpa pod nativním promotorem stabilně transformovány konstrukty pro vybrané jaderné markery. Vyselektované rostliny byly dopěstovány do další generace, jež bude předmětem dalšího výzkumu. Také byl proveden pokus s depolymerizací mikrotubulů Arabidopsis a následné "whole-mount" barvení pro vizualizaci mikrotubulů a proteinu EB1c. Výsledky experimentu naznačují, že depolymerizace mikrotubulů má vliv na lokalizaci EB1c na kortikálních mikrotubulech, nikoliv však na jadernou lokalizaci EB1c proteinu.

Abstract:

Cytoskeleton is an important part of eukaryotic cells it plays role in the cell division, cellular transport of organelles and macromolecules or in response to external stimuli. To fulfil its tasks, cytoskeleton cooperates with a large number of interacting proteins including EB1c which is the main object of this diploma thesis. As a model organism, Arabidopsis thaliana was used. With the help of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) method potential EB1c interacting partners, identified in previous in silico studies, were tested. Microscopic studies of agroinfiltrated tobacco leaves showed possible interaction of EB1c with some of them. To prove these interactions, polyclonal antibody raised against EB1c C-terminal peptide was prepared. Unfortunately, our antibody did not target EB1c protein in the crude extract and we also did not manage to localize the EB1c protein in the seedlings satisfyingly. To study EB1c nucleo-cytoplasmic shuttling during the cell-cycle, Arabidopsis plants expressing EB1c-GFP under the native promoter were crossed with plants expressing some fluorescence-tagged nuclear markers. Further, Col-0, EB1c-GFP and EB1c-Dronpa under the native promoter expressing plants were stably transformed with constructs for chosen nuclear markers. Second generation of selected first generation plants was obtained. Finally, microtubule-depolymerizing experiment with subsequent whole-mount staining to visualize microtubules and EB1c in Arabidopsis was realized. Microtubule depolymerization significantly influenced EB1c localization on cortical microtubules but not EB1c localization in the nucleus.

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, cytoskelet, mikrotubuly, EB1c

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 27. 4. 2017

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Anna Kuchařová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární a buněčná biologie