Tunelový efekt u enzymových a imunochemických biosensorů

Bc. Anna Beňová

Master's thesis

Tunnel effect for enzyme and immunochemical biosensors

Abstract:

Tato diplomová práce je zaměřena na studium tunelového efektu u enzymových a imunochemických biosensorů. Tunelový efekt využívá generování signálu po prostorovém přiblížení dvou komplementárních enzymů v biorekogniční vrstvě na rozhraní převodníku a okolního roztoku. Generovaný signál byl detekován amperometricky. Jako komplementární enzymy byly vybrány glukosaoxidasa a křenová peroxidasa. V první fázi byly studovány enzymové biosensory s enzymy koimobilizovanými na povrchu sítotiskového sensoru. Byl posouzen vliv oddělení těchto enzymů želatinovou mezivrstvou a bylo zjištěno, že nepříliš hustá a tlustá želatinová vrstva umožňuje efektivnější přenos vznikajícího peroxidu vodíku. Peroxid vodíku, jeden z produktů enzymové reakce glukosaoxidasy s glukosou použitou jako substrát, je následně využíván křenovou peroxidasou v peroxidasové reakci. V druhé fázi byly připraveny imunochemické biosensory. Jeden z komplementárních enzymů byl imobilizován na povrchu sítotiskového sensoru a překryt želatinovou mezivrstvou, na kterou byla následně navázána specifická protilátka proti lidskému sérovému albuminu. Druhý enzym byl k systému přiblížen ve formě konjugátu s lidským sérovým albuminem, který vytvořil imunokomplex s imobilizovanou protilátkou. Takto sestrojený systém měl být použitý pro detekci volného albuminu, potažmo měření albuminurie v moči. Imunosensor s imobilizovanou peroxidasou byl vyřazen z experimentů, protože po úvodních měřeních bylo zjištěno, že konjugát albuminu a glukosaoxidasy netvořil imunokomplex. U varianty s imobilizovanou glukosaoxidasou vytvářel konjugát albuminu a peroxidasy imunokomplex s imobilizovanou protilátkou a plánovaný tunelový efekt fungoval. Při měření kompetice s volným albuminem, ale systém vykazoval kladnou proudovou odezvu, která je nekonzistentní s předešlými naměřenými daty a kompetice s volným albuminem je nevyhodnotitelná.Biosensory vykazovaly i jiné problémy, mezi které patřilo zejména bobtnání želatinové mezivrstvy, kvůli tomu trvalo ustalování pozadí nového sensoru přibližně 30 minut.Z těchto důvodů není připravený imunochemický biosensor zatím vhodný k měření množství volného lidského sérového albuminu v reálných vzorcích.

Abstract:

This diploma thesis focuses on the study of the tunnel effect on enzyme-based and immunochemical biosensors. Tunnel effect uses signal generation after the spatial approach of two complementary enzymes in the biorecognition layer on the interface of transducer and the surrounding solution. The generated signal was detected amperometrically. As complementary enzymes, glucose oxidase and horseradish peroxidase were selected. In the first phase enzyme-based biosensors with enzymes co-immobilized on a sensor surface were studied. An effect of the separation of these enzymes by a gelatine interlayer was evaluated and it was found that not very dense and thick gelatine layer allows efficient transfer of the generated hydrogen peroxide. Hydrogen peroxide, one of the products of the enzymatic reaction of glucose oxidase with glucose as a substrate, is subsequently used by horseradish peroxidase in a peroxidase reaction. In the second phase, immunochemical biosensors were prepared. One of the complementary enzymes was immobilized on the sensor surface and covered with a gelatine interlayer on which specific antibody against human serum albumin was subsequently bound. The second enzyme was added to the system in the form of conjugate with human serum albumin, which created immunocomplex with the immobilized antibody and thus formed the tunnelling pair of enzymes. Such system should be used for the detection of free albumin, hence measuring albuminuria in the urine. Immunosensors with immobilized peroxidase were excluded from the experiments, because after the initial measurements, it was found that the conjugate of albumin with glucose oxidase did not form a stable immunocomplex. The variant with the immobilized glucose oxidase, conjugate of albumin with peroxidase generated immunocomplex with immobilized antibody and the planned tunnel effect in this system worked. However, when measuring competition with free albumin, the system showed a positive current response that is inconsistent with previously measured data, so the competition with the free albumin could not be evaluated. Biosensors also exhibited other problems, mainly slow swelling of the gelatine interlayer, due to which it took about 30 minutes for the baseline of a new sensor to get stable. For these reasons, prepared the immunochemical biosensor is not yet suitable for measuring the amount of free human serum albumin in real samples.

Keywords

Amperometrie, Enzymový biosensor, Glukosaoxidasa, Imunosensor, Křenová peroxidasa, Lidský sérový albumin, Tunelový efekt, Amperometry, Enzyme biosensor, Glucose oxidase, Immunosensor, Horseradish peroxidase, Human serum albumin, Tunnel effect

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 13. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 2. 6. 2015
• Supervisor: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry