Identifikace nových meiotických genů pomocí supresorové mutageneze u Arabidopsis

Sorin Tanasa, Ph.D.

Doctoral thesis

Identification of novel meiotic genes through suppressor mutagenesis in Arabidopsis

Abstract:

Meióza je specializované buněčné dělení, během něhož se redukuje diploidní set chromozomů na haploidní, a to ve dvou po sobě jdoucích cyklech jaderného dělení. U krytosemenných rostlin se z haploidních buněk vzniklých meiózou dále diferencují mnohobuněčné haploidní gametofyty. U huseníčku rolního je ukončení meiózy a přechod k diferenciaci pylu zajištěn speciálním mechanizmem, který inhibuje s pomocí genů SMG7 a TDM1 translaci. Inaktivace tohoto mechanizmu vede k tomu, že haploidní jádra vzešlá z meiózy pokračuji v kvazi-meiotických děleních a vniku aberantních mikrospor. Tento neobvyklý fenotyp je s největší pravděpodobností způsoben neúčinnou inaktivací cyklin-dependentní kinázy. Tato práce měla za cíl nalezení a charakterizaci dalších genů, které přispívají k ukončení meiózy, a to pomocí genetického skríningu mutací, které suprimují fenotyp smg7-6 rostlin, a jejich asociačního mapování. Práce je zaměřena na dva geny nalezené tímto skríningem: CENH3, který kóduje centromerový histon, a CDKD;3 kódující cyklin-dependentní kinázu D;3. Zjistil jsem, že snížení exprese centromerového histone mutací cenh3-4 způsobuje zpomalení tvorby mitotického vřeténka, což pravděpodobné přispívá k inhibici aberantních kvazi-meiotických dělení u smg7-6 mutantů. Mutace v CDKD;3 (cdkd;3-3), která zasahuje kinázovou doménu, způsobuje významné zvýšení fertility smg7-6 mutantů. Mikroskopický zobrazováním průběhu meiózy v reálném čase jsme zjistili zpomalení meiózy u cdkd;3-3 smg7-6 mutantů, což pravděpodobně přispívá k tomuto jevu. Ačkoliv CDKD;3 kináza aktivuje CDKA;1, hlavní cyklin-dependentní kinázu regulující buněčný cyklus u huseníčku, naše data naznačují, že efekt cdkd;3-3 na ukončení meiózy je nezávislý od CDKA;1. Dále jsem ukázal, že CDKD;3 účinkuje už v profázi I, kde brání ektopickému formování buněčné stěny. V této práci jsem také zkoumal příspěvek dalších CDKD kináz k regulaci meiózy, a moje data naznačují jejich funkční diferenciaci v tomto procesu. V neposlední řadě má práce popisuje vliv CDKD;3 na genovou expresi pomocí transkripčního profilování, a analýzu CDKD;3 interaktomu pomocí hmotnostní spektrometrie. Tato data přispějí k dalšímu zkoumání funkce této kinázy.

Abstract:

Meiosis is a type of cell division that reduces the number of chromosomes by half through two rounds of chromosome segregation. In flowering plants, it is followed by mitosis to form haploid gametophytes. The end of meiosis and the start of gametophyte development in Arabidopsis are controlled by TDM1 and SMG7, which together inhibit translation. Disruption of this mechanism in mutants leads to multiple abnormal nuclear divisions, likely due to a failure to decrease the activity of cyclin-dependent kinases at meiotic exit. The focus of this thesis was to uncover and then characterize novel regulators of meiotic exit through a genetic screen for suppressors of the smg7-6 phenotype, combined with association mapping for causative gene identification. This work is focused on two mutants that alleviate meiotic defects in smg7 deficient plants: cenh3-4 in the CENH3 gene encoding centromeric histone H3, and cdkd;3-3 in CDKD;3 gene, which encodes cyclin-dependent kinase 3. I found that the cenh3-4 mutation causes delayed formation of mitotic spindle, which may contribute to the suppression of abortive postmeiotic divisions in smg7-6 plants. The cdkd;3-3 mutation causes an amino acid substitution in the CDKD;3 kinase domain and leads to the recovery of pollen viability in cdkd;3-3 smg7-6 plants to around 50% of wild-type plants. Live imaging of meiosis suggests this fertility increase, when compared to smg7-6 plants, is caused by a slower rate of meiotic progression. Although CDKD;3 acts as an activator of CDKA;1, the main cyclin-dependent kinase that regulates meiosis, our results suggest mutants of CDKD;3 promote meiotic exit independently of it. The influence of CDKD;3 on cytokinesis, however, extends as early as prophase, where it prevents premature cell wall formation. I also analyzed contribution of other members of the CDKD family to meiosis and uncovered their functional diversification. Finally, analysis of the cdkd;3 null mutant transcriptome showed a down-regulation of many cell cycle genes, while the CDKD;3 protein interactome was enriched for proteins implicated in cytokinesis, thus opening new directions of research into the functions of this protein.

Keywords

CDKD, 3, SMG7, CENH3, EMS screen, cell cycle, meiosis, cytokinesis, buněčný cyklus, meióza, cytokineze, Arabidopsis thaliana

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 2. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 24. 3. 2023
• Supervisor: Mgr. Karel Říha, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Aleš Pečinka, Ph.D., Ph.D. Helene Robert Boisivon

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics