Úloha proteinů z rodiny transformujícího růstového faktoru beta v regulaci epiteliálně-mesenchymálního přechodu u epiteliálních buněk prostaty

Mgr. Eva Slabáková, Ph.D.

Doctoral thesis

The role of transforming growth factor beta in the regulation of epitelial-to-mesenchymal transition in prostate epithelial cells

Abstract:

Epiteliálně-mesenchymální přechod (EMT) je součástí fyziologických procesů zapojených do embryonálního vývoje nebo hojení ran, během nichž z polarizovaných epiteliálních buněk vznikají pohyblivé buňky mesenchymální. Patologická reaktivace EMT v dospělém organismu je prvním krokem umožňujícím diseminaci nádorových buněk, vedoucí k tvorbě metastáz a terminálním stádiím nádorového onemocnění. Detailní objasnění mechanismů regulujících EMT by umožnilo formulovat efektivnější strategie prevence vzniku metastáz a léčby nádorových onemocnění. Nádorové buňky jsou ovlivňovány celou řadou signálů z nádorového mikroprostředí, které mohou vyústit v regulaci buněčné proliferace, diferenciace i apoptózy. Pro cytokiny z rodiny transformujícího růstového faktoru-beta (TGF-beta) je charakteristická široká škála účinků na nádorovou progresi. Zatímco inhibice proliferace epiteliálních buněk působí protinádorově, indukce EMT spojená se zvýšenou pohyblivostí nádorových buněk má účinek opačný. EMT se projevuje změnami buněčné morfologie i expresního profilu epiteliálních a mesenchymálních znaků. Úplná i částečná změna fenotypu je řízena souhrou mnoha transkripčních faktorů a mikroRNA, které mohou interagovat četnými vzájemnými regulacemi a zpětnými vazbami. Cílem této práce bylo analyzovat expresi a funkci vybraných transkripčních faktorů a mikroRNA v procesu EMT u benigních i transformovaných epiteliálních buněk prostaty, s cílem identifikovat klíčové molekuly zodpovědné za zisk nádorových a invazivních vlastností u buněk prostaty. Pro studium EMT byla využita zejména benigní buněčná linie BPH-1, odvozená z epitelu prostaty, a tumorigenní klony vytvořené její transformací. EMT byl indukován působením cytokinu TGF-beta s následnou analýzou exprese epiteliálních a mesen-chymálních znaků, transkripčních faktorů a mikroRNA, doprovázenou studiem signálních drah cytokinu TGF-beta. Závěrečné funkční experimenty byly navrženy s cílem objasnit úlohu vybraných molekul v nastolení či udržení fenotypu EMT, včetně identifikace případných mechanismů vzájemné regulace. Naše výsledky ukazují, že transkripční faktor SNAI2/Slug je důležitým raným regulátorem procesu EMT, indukovaného v epiteliálních buňkách prostaty cytokinem TGF-beta. Nádorová transformace buněk prostaty je doprovázena nejen změnami exprese epiteliálních a mesenchymálních znaků, ale i posílenými migračními schopnostmi a zvýšenou expresí transkripčních faktorů SNAI2/Slug, Twist a ZEB. Jak SNAI2/Slug, tak Twist mohou regulovat expresi určitých znaků EMT i buněčnou migraci ve funkčních experimentech. Celkově tedy naše výsledky svědčí o významné úloze endogenních transkripčních faktorů SNAI2/Slug a Twist v regulaci EMT a invazivity u epiteliálních buněk prostaty, přičemž jejich zvýšená exprese může být považována za znak nádorové transformace.

Abstract:

Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT), in which epithelial cells lose their polarity and become motile mesenchymal cells, is implicated in physiological processes such as embryonic development or wound healing. When inappropriately activated in the adult organism, it represents an essential early step facilitating dissemination of tumor cells, leading to formation of metastasis and terminal stage of cancer disease. A clear understanding of cellular mechanisms leading to the modulation of EMT could potentially lead to more effective strategies of metastasis prevention and cancer treatment. Cancer is not a single cell disease, and cancer cells respond to complex stimuli from the tumor microenvironment by modulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Pleiotropic effects on cancer progression are typical for cytokines from the transforming growth factor-beta (TGF-beta) family, and are exemplified by cancer-suppressing inhibition of epithelial cell proliferation, or cancer-promoting facilitation of cell dissemination, underlain for example by induction of EMT. An EMT phenotype is characterized by changes in cell morphology and behavior, accompanied by modulation of expression of multiple epithelial and mesenchymal-specific proteins. The complete or partial phenotypic change is orchestrated by multiple transcription factors and microRNAs, acting in a complex network of cross-regulatory mechanisms and feedbacks. The aim of this study was to analyze the expression and function of selected transcription factors and miRNAs in the EMT of both benign and transformed prostate epithelial cells in order to identify key molecules responsible for tumorigenicity and invasivity of prostate cancer. In our experimental system, parental and tumorigenic clones derived from non-tumorigenic prostate epithelial cell line BPH-1 were induced to undergo EMT by TGF beta1 treatment. Analysis of expression of epithelial and mesenchymal markers, EMT-regulating transcription factors and microRNAs was followed by analysis of TGF-beta signaling pathways. Finally, specific targeting of selected molecules allowed assessment of their function in the generation or maintenance of the EMT phenotype, and revealed potential cross-regulatory mechanisms. Our results show that the transcription factor SNAI2/Slug is an important early regulator of TGF-beta-induced EMT in prostate epithelial cells. Moreover, cancer transformation of prostate cells is accompanied by acquisition of EMT markers, enhanced migration potential and increased expression of SNAI2/Slug, Twist and ZEB transcription factors. Both SNAI2/Slug and Twist can regulate expression of certain EMT markers, and functional experiments have confirmed a crucial role of both SNAI2/Slug and Twist in the regulation of motility of prostate epithelial cells. Altogether, our results suggest that in prostate epithelial cells, endogenous SNAI2/Slug and Twist are important regulators of EMT, tumorigenicity and invasivity and their overexpression is a hallmark of cancer transformation.

Keywords

epithelial-to-mesenchymal transition/EMT, transforming growth factor-beta, prostate carcinogenesis, metastasis, cell migration, SNAI2/Slug, Twist epiteliálně-mesenchymální přechod/EMT, transformující růstový faktor-beta, karcinogeneze prostaty, metastáze, buněčná migrace

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 1. 8. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 15. 9. 2011
• Supervisor: Mgr. Karel Souček, Ph.D.
• Reader: MD. Peter Horak, Mgr. Jan Bouchal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biology (4-years) / Animal Physiology