Epigenetické procesy v regulaci udržování telomer

Bc. Eva Majerová, Ph.D.

Master's thesis

Epigenetic processes in regulation of telomere maintenance

Abstract:

Diplomová práce se zabývá sledováním změn ve stavbě telomer po navození celogenomové hypomethylace. Pro tyto účely byla vybrána chemikálie S-9-(2,3-dihydroxypropyl) adenin (DHPA), která funguje jako kompetitivní reversibilní inhibitor hydrolázy S-adenosyl-L-homocysteinu. Tato hydroláza je zodpovědná za hydrolýzu L-homocysteinu, což je látka vznikající z S-adenosyl-L-methioninu odtržením methylové skupiny. DHPA proto účinně zasahuje přímo do procesu methylace DNA i histonů, čímž se stává ideálním činidlem pro navození hypomethylace. Jako vhodný materiál byl vybrán rostlinný modelový organismus N. tabacum a z něho odvozené buňky TBY-2. Tyto buňky byly pěstovány na několika různých koncentracích DHPA a po jejich sklizení byl materiál podroben analýze délky terminálních restrikčních fragmentů (TRF), analýze stupně methylace DNA a analýze aktivity telomerázy. Byly sledovány nejen změny způsobené přímým ovlivňováním buněk, ale i případný návrat do původního stavu po odstranění hypomethylačního činidla. Cílem práce bylo ověřit pozorování u savčích buněk, že navozením masivní hypomethylace je dosaženo prodlužování telomer za nezměněné aktivity telomerázy. V první řadě tato práce potvrdila vliv DHPA jako cytotoxického činidla, a to zejména je-li podáváno dlouhodobě ve vysokých koncentracích (nad 25µM). Při sledování změn stavu methylace DNA v subtelomerové repetitivní oblasti HRS60 bylo potvrzeno, že DHPA působí jako hypomethylátor, když u ovlivňovaných buněk došlo k výraznému úbytku methylace. Vzhledem k tomu, že hypomethylace byla nejvyšší v první pasáži a dále mírně klesala, autorka se domnívá, že došlo k selekci buněk částečně resistentních k DHPA. Po pasáži buněk do růstového média bez DHPA byl pozorován nárůst methylace téměř do původního stavu, hodnot kontrolních skupin buněk ale dosaženo nebylo. Co se týče změny délky telomer, tato práce nepotvrdila výsledky z ostatních pracovišť o vlivu methylace na délku telomer, které byly získány u savčích buněk. Ze zjištěných hodnot jasně statisticky vychází, že nedošlo k signifikantní změně délek telomer mezi pozorovanými skupinami buněk. Závěrem proto musí být uvedeno, že nebyla zjištěna žádná příčinná souvislost mezi úrovní methylace a délkou telomer. Výsledky vypovídající o aktivitě telomerázy v ovlivňovaných i kontrolních buňkách bohužel nejsou součástí práce, a to z důvodu komplikované optimalizace metody TRAP (telomeric repeat amplification protocol) pro rostlinné buňky N. tabacum.

Abstract:

The presented diploma thesis deals with the monitoring of changes in the structure of telomeres after the whole-genomic hypomethylation. For this purpose S-9-(2,3-dihydroxypropyl)adenine was chosen, which works as a reversible competitive inhibitor of S-adenosyl-L-homocystein hydrolase. This hydrolase is responsible for lyses of L-homocystein, which is a substance that rises from S-adenosyl-L-methionin by ripping off the active methyl group. So DHPA interferes directly with the core mechanism of DNA and histone methylation, which makes it the ideal agent for inducing the hypomethylation. As a suitable material a plant model organism Nicotiana tabacum, particularly its TBY-2 cells were chosen. These cells were cultivated on different concentrations of DHPA and when harvested, the terminal restriction assay (TRF), methylation pattern assay and telomere repeat amplification protocol (TRAP) were proceeded. The observation was focused not only on direct changes after the treatment but also on reversibility of these possible changes after the end of treatment. The aim of work was to confirm the hypothesis made for mice stem cells – by inducing the massive hypomethylation the telomeres elongate with no changes in telomerase activity. Firstly this work confirmed the cytotoxicity of DHPA, mostly if it is used continually in high concentrations (higher than 25µM). While analyzing the DNA methylation pattern in subtelomeric repetitive region HRS60 was verified that DHPA really works as a hypomethylator. The highest hypomethylation occurred in first passage and than were slightly decreasing, which can be caused by a strong selection of cells partly resistant to DHPA. At the end of a treatment the methylation level increased nearly to a primary level, the same methylation level as in control cells has never been re-established. As regards to the changes in telomere length, this work didn’t confirm the results about influence of methylation in telomere length from other laboratories in mammalian cells. Statistical analyses of given results clearly showed no changes in telomere length between control and treated cells. So at this place it must be summarized that no causal relationship between methylation level and length of telomeres was found. The results showing the activity of telomerase in treated cells are not included in this diploma thesis because of the complicated optimization of TRAP method for tobacco cells.

Keywords

telomery, telomeres, epigenetika, epigenetics, hypomethylace, hypomethylation, DHPA, methylace, methylation, regulace délky telomer, telomere length regulation, aktivita telomerázy, telomerase activity, TRF terminal restriction fragments, TRAP, TBY-2

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics