Zavedení a základní validace HPLC metodiky pro kvalitativní a kvantitativní analýzu fenolových látek obsažených v listech Arabidopsis thaliana

Bc. Magdaléna BUREŠOVÁ

Master's thesis

Development and basic validation of HPLC method for qualitative and quantitative analysis of phenolic compounds in leaves of Arabidopsis thaliana

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývá problematikou separace volných fenolových látek (FL) z extraktů listů Arabidopsis thaliana pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s optickým absorpčním detektorem typu diodového pole (HPLC-DAD). Součástí práce byla také validace vyvinuté metody. Z celkem 8-11 látek vyskytujících se v extraktech pořízených z rostlin vypěstovaných na vysoké intenzitě ozářenosti (HI, 1000 ?mol m-2 s-1) fotosynteticky aktivního záření (FAR) byly ve formě standardů zakoupeny dva deriváty kempferolu (kempferol-3-O-glukosid-7-O-rhamnosid, kempferol-3-O-rhamnosid-7-O-rhamnosid), dva deriváty kvercetinu (kvercetin-3-O-glukosid-7-O-rhamnosid, kvercetin-3-O-rhamnosid-7-O-rhamnosid) a jeden z esterů kyseliny sinapové (sinapoylglukóza). Pro zmíněné látky byly stanoveny parametry selektivita, linearita, meze detekce a kvantifikace a byly vytvořeny kalibrační rovnice. Správnost byla stanovena jen pro deriváty kempferolu a sinapoylglukózu, jelikož oba deriváty kvercetinu koeluují s dalšími látkami v extraktu a není možné je kvantifikovat. Pomocí kalibračních řad byly získány rovnice umožňující kvantitativní stanovení vybraných FL v extraktu. Metoda není selektivní pro některé deriváty kvercetinu a kyanidinu, které koeluují s majoritními FL obsaženými v extraktu. Vytvořené kalibrační rovnice umožňují absolutní kvantifikaci kempferol-3-O-glukosid-7-O-rhamnosidu a kempferol-3-O-rhamnosid-7-O-rhamnosidu v rostlinném materiálu. Sinapoylglukóza se v listech nachází v koncentracích pod mezí stanovitelnosti. Pro všechny standardy byly koeficienty determinace vyšší než 0,999 pro koncentrace 100 (u sinapoylglukózy 50) až 0,78 (pro některé látky až 0,39) ?g standardu/ml. Meze detekce (LOD) a stanovitelnosti (LOQ) se pohybovaly od 0,7 do 2,3 ng látky v nástřiku (LOD) a od 2,2 do 7,6 ng látky v nástřiku pro LOQ . Správnost stanovená pro oba deriváty kempferolu (kempferol-3-O-glukosid-7-O-rhamnosid, kempferol-3-O-rhamnosid-7-O-rhamnosid) byla lepší než ?15 %. Validovanou metodou byly analyzovány extrakty (40% metanol) pořízené z listů rostlin vypěstovaných na vysoké (HI, 1000 ?mol m-2 s-1) a nízké (LI, 100 ?mol m-2 s-1) ozářenosti FAR. U HI extraktů bylo separováno 10 látek, jejichž koncentrace ve výchozím rostlinném materiálu byla stanovena na desítky až stovky ?g g-1 čerstvé hmotnosti (FW) listu. Koncentrace sedmi FL zjištěných v LI extraktech byly řádově nižší a pohybovaly se spíše na úrovni desítek ?g g-1 FW rostlinného materiálu. V LI extraktech nebyly detekovány žádné deriváty kvercetinu.

Abstract:

This thesis deals with HPLC-DAD separation of free phenolic compounds (PC) isolated from leaves of Arabidopsis thaliana. Method validation was also included. Five standards of 8-11 compounds observed in plants grown under high irradiance of photosyntheticly active radiation (PAR) were purchased: two kaempferol derivatives (kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside, kaempferol-3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside), two quercetin derivatives (quercetin-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside, quercetin-3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside) and a sinapate ester sinapoylglucose. Selectivity, linearity and limits of detection and quantitation were determined and calibration curves were constructed for the above mentioned compounds. Accuracy was determined only for kaemfperol derivatives and sinapoylglucose. Both quercetin derivatives coelute with other metabolites contained in the extract and can not be quantified. Calibration curves were constructed for all standards. Selectivity of the validated method is low for some quercetin derivatives and anthocyanins due to coelution with major compounds contained in the extract. Acquired calibration equations enable exact quantitation of kaempferol-3-O-glucoside-7-O-rhamnoside and kaempferol-3-O-rhamnoside-7-O-rhamnoside in analyzed extracts. Sinapoylglucose was found not to exceed the limit of quantitation. For all standards regression coefficients were higher than 0.999 for the range of concentrations 100 (50 for sinapoylglucose) to 0.78 (0.39 for some of the standarads) ?g/ml. Limits of detection (LOD) ranged from 0.7 to 2.3 ng per injected mass and limits of quantitation (LOQ) ranged between 2.2 and 7.6 ng. Accuracy determined for both kaempferol derivatives was better than ?15 %. Validated method was tested in analysis of extracts (40% methanol) prepared from leaves of plants grown under high irradiance (HI, 1000 ?mol m-2 s-1) and low irradiance (LI, 100 ?mol m-2 s-1) of PAR. The amount of ten compounds detected in HI extracts was assessed to be tens to hundreds ?g g-1 fresh weight (FW) of plant material. In LI extracts quercetin derivatives were completely missing and only seven compounds on concentration level of tens ?g g-1 FW were detected.

Keywords

HPLC-DAD, validace, fenolové látky, Arabidopsis thaliana, intenzita ozářenosti FAR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 21. 6. 2019

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 15. 8. 2019
• Supervisor: Mgr. Jakub Nezval, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Applied Physics / Biophysics