Ekotoxikologické aspekty huminových látek

RNDr. Michal Bittner, Ph.D.

Doctoral thesis

Ecotoxicological aspects of humic substances

Abstract:

Huminové látky (HS) představují všudypřítomné produkty rozkladu odumřelé organické hmoty. Jejich chemické složení závisí na zdroji degradovaného materiálu, a proto není možné určit jejich přesnou chemickou strukturu ani jednotné vlastnosti. HS obsahují velké množství funkčních skupin a hydrofobních struktur zodpovědných za interakci HS s okolními anorganickými i organickými látkami. Důsledkem je snížení biodostupnosti těchto látek, popisované jako nepřímý účinek HS na organismy. Navzdory poměrně velkým agregátům HS však bylo také prokázáno, že látky typu HS mohou pronikat do živých buněk vodních organismů a následně působit přímým účinkem. Popsána tak byla např. změna exprese proteinů teplotního šoku, zvýšení množství biotransformačních enzymů, ovlivnění fotosyntetické tvorby kyslíku u rostlin, účinky hormonálního typu u živočichů, atd. Také již byly popsány případy přímé interakce HS s vnitrobuněčnými receptory. Receptor pro planární aromatické látky (AhR) představuje ekotoxikologicky velice důležitý vnitrobuněčný receptor, který zprostředkovává toxické účinky kontaminantů životního prostředí, a to především polychlorovaných dioxinů, furanů a bifenylů. Byla již ale také identifikována řada strukturně velmi variabilních látek schopných interakce s AhR. My jsme provedli otestování AhR zprostředkované aktivity různých druhů HS - huminových kyselin (HA), fulvokyselin (FA) a rozpustné organické hmoty (NOM). Toto testování bylo provedeno za použití in vitro biotestu založeného na transgenní buněčné linii H4IIE-luc. Koncovkou tohoto biotestu je luminiscenční stanovení luciferázy, která je v buňkách exprimována po aktivaci AhR. Z důvodu bližší charakterizace AhR aktivních složek HS jsme otestovali jak samotné vodné roztoky HS, tak také jejich organické extrakty a organické extrakty ošetřené H2SO4. Výsledkem bylo zjištění významné AhR zprostředkované aktivity u pěti vzorků HA a jejich organických extraktů, zatímco organické extrakty ošetřené H2SO4 aktivitu nevykazovaly. Dále jsme studovali aktivaci dalšího vnitrobuněčného receptoru - estrogenního receptoru (ER). ER představuje cíl pro přirozené estrogenní hormony, avšak jeho funkce může být také ovlivněna tzv. xenoestrogeny, to jest látkami patřícími do skupiny endokrinních disruptorů. Podobně jako u testování AhR zprostředkované aktivity jsme i zde využili analogického in vitro biotestu založeného na transgenní buněčné linii. Linie MVLN však narozdíl od linie H4IIE-luc odpovídá luminiscenčním signálem na aktivaci ER. Testováním jsme zjistili významnou antiestrogenitu u deseti z dvanácti testovaných vzorků HS, zatímco estrogenita nebyla zjištěna u žádného vzorku HS, a to jak v přítomnosti tak i nepřítomnosti přirozeného ligandu ER, 17-beta-estradiolu. Ve srovnání s AhR zprostředkovanou aktivitou však byl zjištěn významný antiestrogenní účinek nejenom u HA, ale i u FA a NOM. Jelikož molekuly HS obsahují množství chromoforů, tedy aromatických struktur a konjugovaných dvojných vazeb, vede ozáření rozpuštěných HS k sérii fotochemických reakcí. Těchto reakcí se účastní jak HS samotné, tak i jiné okolní látky jako např. xenobiotika. V další studii jsme se tedy zaměřili na změny absorbance a AhR zprostředkovaných aktivit HS po ozáření simulujícím přirozené sluneční záření. V závislosti na době ozařování došlo k významnému poklesu absorbance u všech vzorků HS. AhR zprostředkovaná aktivita dvou vzorků HA (HA-Fluka a HA Sodium Salt) po ozáření částečně také poklesla, zatímco aktivita ostatních vzorků, jak AhR-aktivních tak i neaktivních, se po ozáření nezměnila. Tyto výsledky ukazují, že aktivita zprostředkovaná AhR je u dvou AhR-aktivních

Abstract:

HA způsobena jak fotolabilními, tak i fotostabilními ligandy AhR, zatímco zbývající tři AhR-aktivní HA obsahují pouze fotostabilní ligandy AhR.

Abstract:

Humic substances (HS) represent ubiquitous products of dead organic matter decomposition, whose chemical constitution depends on the source of parent materials - therefore, exact structure and properties of HS are unpredictable. HS contain great amount of functional groups and hydrophobic structures that implies interaction of HS with surrounding both inorganic and organic compounds. This results in indirect effects of HS on organisms due to decreased bioavailability of affected compounds. Despite the rather large HS aggregates, it was also shown that HS-like substances can be taken up into the cells of aquatic organisms and subsequently exert direct biological effects - e. g. change expression of heat shock proteins, modulation of biotransformation enzymes, modulation of photosynthetic oxygen release, hormone-like effects on animals, etc. Direct interaction of HS with several intracellular receptors has also been described. Aryl hydrocarbon receptor (AhR) represents ecotoxicologically really important intracellular receptor, which mediates the toxic effects of environmental contaminants such as polychlorinated dioxins, furans and biphenyls. Nevertheless number of other structurally diverse compounds has also been found to activate AhR. We have evaluated the AhR-mediated activity of various types of HS - humic acids (HA), fulvic acids (FA) and natural organic matter (NOM) - using in vitro bioassay based on transgenic H4IIE-luc cell line. Endpoint of this bioassay is luminescence determination of luciferase that is expressed in the cells after the AhR activation. On account of more detailed characterization of AhR-active HS compartments, activities of aqueous HS solutions, organic extracts and H2SO4-treated HS extracts were examined. Results of our studies revealed significant AhR-mediated activities of five HA out of twelve HS tested, where both alkali HS solutions and organic HS extracts exerted activity, but H2SO4-treated extracts were non-active. In further study, the interaction of HS with another intracellular receptor - estrogen receptor (ER) - was examined. ER is a target for natural estrogen hormones, but can also be affected by so called “xenoestrogens”, i.e. compounds belonging to the group of endocrine disruptors. Similar to assessment of AhR mediated activity, analogous transgenic cell-based in vitro bioassay was employed. Compared with H4IIE-luc cell line, MVLN cell line gave the luminescence response after the ER activation. None of the twelve tested HS showed any estrogenic activity both in absence and presence of ER agonist 17-beta-estradiol; but ten HS have exerted significant antiestrogenic activity. Compared to AhR-mediated activity, these antiestrogenic effects were observed not only after HA treatment, but also after FA and NOM treatment. Since HS molecules contain number of chromophores - i.e. aromatic rings and conjugated double bonds, the natural irradiation of dissolved HS can lead to a series of photochemical reactions. These reactions can act on the HS itself, but also on other substances surrounding HS, such as e.g. xenobiotics. Thus, we have also studied the changes in AhR-mediated activities and absorbance of HS after irradiation that simulated natural solar light. After irradiation the absorbance of all of the HS was lower that of the original samples. The AhR mediated activities of two HA samples (HA-Fluka and HA Sodium Salt) were partially decreased in dependence on irradiation, while activities of other HS, both AhR-active or -inactive, were not changed by irradiation. Results of our measurements demonstrate that AhR-mediated activities of two active HA is caused by both photo-stable and photo-labile AhR activators, while other three active HA contain only photo-stable AhR activators.

Keywords

Huminové látky, AhR, ER, in vitro biotest, fototransformace, účinky na organismy Humic substances, in vitro bioassay, photo-transformation, effects on organisms

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 2. 2007

Thesis defence

• Date of defence: 20. 2. 2007
• Supervisor: prof. RNDr. Ivan Holoubek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Chemistry / Environmental Chemistry