Fotofyzikální charakteristiky fluorescenčních substrátů pro enzymologii

Bc. Veronika Dočkalová

Bachelor's thesis

Photophysical characteristics of fluorescent substrates for enzymology

Abstract:

Fluorescence je spontánní emise fotonů při přechodu molekuly z excitovaného stavu do základního stavu, která je zapříčiněna absorpcí elektromagnetického záření. Fluorescenční spektroskopie patří mezi analytické metody, které nabízí široké uplatnění napříč různými vědeckými disciplínami. Díky vysoké citlivosti detekce navíc představuje jedinečný nástroj pro studium živých i neživých soustav a to i na úrovni jedné molekuly. Jednou z mnoha oblastí uplatnění fluorescenční spektroskopie je enzymologie. Enzymy jsou biomakromolekuly katalyzující většinu metabolických procesů. Pro porozumění mechanismu činnosti enzymů je nezbytné studovat kinetiku jejich reakcí. K tomu je možné použít mnoho metod, jednou z nejefektivnějších je sledování reakcí enzymů s fluorescenčními substráty, které v průběhu reakce mění své spektrální vlastnosti. Tato bakalářská práce je zaměřena na problematiku fluorescence, fluorescenčních substrátů a jejich použití při kinetických studiích enzymových reakcí. Experimentální část práce se věnuje hledání a charakterizaci nových fluorescenčních substrátů pro enzymy ze skupiny halogenalkandehalogenáz. Ze čtyř testovaných látek byla identifikována jedna látka, která vykazovala významnou změnu fluorescence při reakci s některými modelovými enzymy. Dále bylo prokázáno, že tuto látku je možné použít pro měření ustálené kinetiky . V další části práce byla rozvinuta metodika pro měření tranzitní kinetiky modelových enzymů s novým i dříve identifikovaným fluorescenčním substrátem.

Abstract:

Fluorescence is the spontaneous emission of photons occurring from electronically excited states of a molecule that has absorbed electromagnetic radiation. Fluorescence spectroscopy provides broad applicability in many scientific disciplines. Moreover, thanks to the high sensitivity of detection, fluorescence spectroscopy represents a unique tool for the study of both living and non-living systems even at single-molecule level. One of the areas where fluorescence spectroscopy is widely used is enzymology. Enzymes are biomacromolecules catalysing majority of metabolic processes. In order to understand the mechanism of enzyme function, study of the kinetics of their reactions is necessary. Many methods can be utilized for this purpose, one of the most efficient being the study of enzyme reactions with a fluorescent substrate which changes its spectral properties during reaction. This bachelor thesis is focused on fluorescence, fluorescent substrates and their use for kinetic studies of enzymatic reactions. The experimental part of the thesis is dedicated to discovery and characterisation of novel fluorescent substrates for enzymes from haloalkane dehalogenase family. One of the four tested substances exhibited a significant change in its fluorescence during enzymatic reaction with model enzymes. Moreover, this substance was successfully used for the measurement of steady-state kinetics. Further, the thesis is also focused on developing of methodology for measurement of transient kinetics with model haloalkane dehalogenases with new and previously identified fluorescent substrate.

Keywords

Fluorescence, Enzym, Fluorescenční substrát, Enzymová kinetika, Techniky na úrovni jedné molekuly, Halogenalkandehalogenázy, Enzyme, Fluorescent substrate, Enzyme kinetics, Single-molecule techniques, Haloalkane dehalogenases

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2016

Thesis defence

• Date of defence: 20. 6. 2016
• Supervisor: prof. RNDr. Zbyněk Prokop, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Physics / Physics