Optimalizace detekce sfRNA viru klíšťové encefalitidy v RNA z hostitelských buněk pomocí hybridizačních technik

Valentýna KRÁLOVÁ

Bachelor's thesis

Abstract:

Tato studie se zaměřuje na optimalizaci metody dot-blot pro detekci sfRNA v RNA izolované z lidských nervových buněk DAOY HTB 186 infikovaných sfRNA nebo TBEV. Optimalizace vedla k úspěšné detekci sfRNA hybridizačního signálu. Byl však pozorován nespecifický hybridizační signál v negativní kontrole a pokusy o jeho odstranění nevedly ke zlepšení specifičnosti signálu ani k identifikaci zdroje nespecifického hybridizačního signálu pomocí Northern blotu. Byla rovněž provedena optimalizace qRT-PCR eseje pro kvantifikaci sfRNA v lidských nervových buňkách DAOY HTB 186 infikovaných sfRNA nebo TBEV. Zajímavé je, že esej qRT-PCR převzatá od Schwaiger M., Cassinotti P., 2003 nefungovala efektivně při použití chemie qRT-PCR zavedené pro esej qRT-PCR v naší laboratoři, a proto nemohla být použita pro spolehlivou kvantifikaci sfRNA ve vzorcích použitých v této práci. Pokusy o návrh vlastního qPCR eseje pro kvantifikaci sfRNA také nefungovaly nejspíše kvůli obtížně vytvořeným sekundárním strukturám ve struktuře sfRNA.

Abstract:

This study focuses on the optimization of dot-blot method for detection of sfRNA in RNA isolated from sfRNA-transfected or TBEV-infected DAOY HTB-186 human neural cells The optimization led to successful detection of sfRNA hybridization signal. however, unspecific hybridization signal in negative control were observed and attempts to remove it failed to improve signal specificity or unspecific hybridization signal source identity using Northern blot. The optimization of qRT-PCR essay for quantification of sfRNA in sfRNA-transfected or TBEV-infected DAOY HTB-186 human neural cells was also performed. Interestingly, the qRT-PCR essay adopted from Schwaiger M., Cassinotti P., 2003 failed to perform efficiently using qRT-PCR chemistry established for qRT-PCR essays in our laboratory and thus could not be used for reliable quantification of sfRNA in samples used in this work. Attempts to design custom qPCR essay for sfRNA quantification also failed to work most probably due to difficult secondary structures formed in the sfRNA structure.

Keywords

virus klíšťové encefalitidy (TBEV), subgenomová flavivirová RNA (sfRNA), qRT-PCR esej, metoda dot-blot, metoda Northern blot

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Pavlína Věchtová, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biology / Biomedical Laboratory Techniques