ARF family in barley and their role in crown-root initiation and development

Mgr. Nikola KOŘÍNKOVÁ

Master's thesis

Abstract:

AUXIN RESPONSE FACTORs (ARFs) represent a large family of transcription factors, that function as either activators or repressors of the early auxin-responsive genes. As a part of the auxin signaling pathway, ARFs regulate many developmental processes in plants. The role of ARFs in the process of crown-root initiation and development in barley was studied. In this work, 21 ARF proteins were identified in barley. From these, 8 ARFs were predicted to act as activators and 13 as repressors. A heat-map of ARF expression was generated, showing that most ARF genes are expressed among different barley tissues and the level of their expression varies during development. Focusing on the ARF repressors, changes in the expression profiles during the early crown development were observed, suggesting a role of these ARFs in the process of crown-root formation. For future analysis of the spatial distribution of ARF transcripts in crown tissue, in situ PCR protocol was improved and further optimization steps were proposed. In the next part, a candidate for the main inhibitor of crown-roots in barley was determined. Constructs for the CRISPR-Cas9-mediated knock-out of the candidate HvARF13 gene were prepared. By the method of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of barley immature embryos, six transgenic plants were obtained. Mutation in HvARF13 sequence was confirmed in one plant. Altogether, results presented in this thesis will help to further characterize the role of ARFs in barley.

Abstract:

AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) proteiny představují velkou rodinu transkripčních faktorů, jejichž funkcí je aktivace nebo represe genů primární odpovědi na auxin. ARF jako součást auxinové signální dráhy regulují mnoho vývojových procesů rostlin. Byla studována role ARF proteinů v procesu zakládání a vývoje nodálních kořenů v ječmenu. V této práci bylo identifikováno 21 ARF proteinů v ječmenu, z nichž 8 ARF byla predikována funkce aktivátorů a 13 funkce represorů. Byla vytvořena teplotní mapa exprese ARF, která ukazuje, že většina ARF genů je exprimována napříč různými pletivy ječmene a úroveň jejich exprese se mění během vývoje. U ARF represorů byly pozorovány změny v expresních profilech během raného vývoje báze stonku, které naznačují roli těchto ARF v procesu tvorby nodálních kořenů. Pro budoucí analýzu prostorového rozložení ARF transkriptů v bázi stonku byl zdokonalen protokol in situ PCR a byly navrženy další kroky pro optimalizaci této metody. V následující části práce byl určen kandidátní ARF na funkci hlavního inhibitoru nodálních kořenů v ječmenu. Byly připraveny konstrukty pro vypnutí kandidátního genu HvARF13 pomocí CRISPR-Cas9. Metodou transformace nezralých embryí ječmene pomocí Agrobacterium tumefaciens bylo získáno 6 transgenních rostlin. Mutace v sekvenci HvARF13 byla potvrzena u jedné rostliny. Výsledky prezentované v této práci pomohou dále charakterizovat roli ARF v ječmenu.

Keywords

nodální kořeny, Hordeum vulgare L., ARF, auxin

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2019
• Supervisor: Véronique Hélene Bergougnoux-fojtik, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering