Optimalizace exprese rekombinantních proteinů v kvasince Pichia pastoris

Bc. Michal Obořil

Diplomová práce

Optimalization of recombinant protein expresion in yeast Pichia pastoris

Anotace:

Expresní systém kvasinky Pichia pastoris se ve velkém měřítku používá na produkci rekombinantních proteinů již několik desetiletí. Pichia pastoris v sobě spojuje výhody eukaryotních i prokaryotních expresních systému. V rámci mé práce byly ve fermentoru produkovány mutantní formy proteinu cryptogeinu. Cryptogein, malý 10 kDa bazický protein patřící do rodiny elicitinů, je sekretován vysoce patogenní oomycetou Phytophthora cryptogea a vyvolává na rostlinách tabáku hypersenzitivní reakci. Molekula cryptogeinu obsahuje kavitu, do které se mohou vázat steroly a mastné kyseliny, kdy vazba sterolu vyvolává v rámci proteinu strukturní posun v omega smyčce. Z tohoto hlediska cryptogein patří mezi tzv. “sterol přenášející proteiny“. Na základě výsledků z předchozích studií se předpokládá nezbytnost vazby sterolu pro biologickou aktivitu proteinu. V bioreaktoru bylo vyprodukováno a vypurifikováno pět proteinů: X24, L41F, V84F, V84F/L41F a K13V s průměrnými výtěžky 40-60 mg proteinu na litr bazálního media. Buněčné hustoty na konci fermentace dosahovali 250-300 g/l. U jednotlivých exprimovaných proteinů byli pomocí fluorimetrie stanoveny biologické aktivity, jako schopnost přenášet steroly a mastné kyseliny. Dále byly pomoci fluorimetrie stanoveny disociační konstanty komplexu cryptogein-sterol.

Abstract:

Expression system Pichia pastoris has been used for decades to production of recombinant proteins in large scale. Pichia pastoris combines the advantages of eukaryotic and prokaryotic expression systems. In my work mutant forms of protein cryptogein were produced in the fermenter. Cryptogein is a small 10 kDa basic protein belongs to the family of elicitins. It is secreted by highly pathogenic oomycetes Phytophthora cryptogea and it triggers on tobacco plants hypersensitivity reaction. Cryptogein molecule contains a cavity, to which sterols and fatty acids can bind to. The binding of sterol evoke structural shift in the omega loop of protein. From this perspective, cryptogein belongs to the so-called "sterol carrying proteins“. Based on previous results we can suppose that binding of sterol is necessary for biological activity. Five proteins: X24, L41F, V84F, V84F/L41F and K13V were produced in the bioreactor and purified with average yields of 40-60 mg protein per liter of basal media. Cell density was reached 250-300 g/l at the end of fermentation. Biological activity of expressed proteins as the ability to transfer sterols and fatty acids were determined by fluorimetry. Further, dissociation constants of the cryptogein-sterol complex were provided by fluorimetry as well.

Klíčová slova

Pichia pastoris, fermentor, cryptogein, Phytophthora cryptogea, Tabáková rostlina

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 9. 6. 2010
• Oponent: doc. Mgr. Jan Lochman, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie