Optimalizácia prípravy lipozomálnych nosičov pre cielený transport terapeutických nukleových kyselín

Ester Maráková

Bakalářská práce

Optimalizace přípravy lipozomálních nosičů pro cílený transport terapeutických nukleových kyselin

Anotace:

Tato bakalářská práce s názvem „Optimalizace přípravy lipozomálních nosičů pro cílený transport terapeutických nukleových kyselin“ se zabývá využitím lipozomálních nanopřenašečů a mechanismu RNA interference prostřednictvím siRNA v cílené terapii. Cílem této práce bylo optimalizovat přípravu komplexu liposomů, polyethylenkglykolu a siRNA pro další výzkum a vypracovat odbornou rešerši o této problematice. V rámci praktické části této práce byly připraveny kationické lipozomy ze směsi lipidů v molárním poměru 20:50:10:20 (DODAG, DOPE, cholesterol, CPA·HCl), do kterých byla po extruzi enkapsulována kontrolní siRNA a na jejich povrch byly navázány dva druhy polyethylenglykolu: PEG2000 a PEG2120. Praktická část této práce sestávala ze tří hlavních experimentů, kterými byly: sledování vlivu množství enkapsulované siRNA, sledování vlivu míry PEGylace a stabilitní studie dlouhodobého skladování liposomů po dobu tří měsíců. V závěru této práce byly vybrány vzorky liposomů vyfotografovány na skenovacím elektronovém mikroskopu. Ve všech experimentech byla pomocí dynamického rozptylu světla sledována velikost, PDI a ζ potenciál. V experimentu, který se zabýval vlivem množství enkapsulované siRNA, jsme zaznamenali se zvyšujícím se množstvím siRNA nárůst velikosti. Na základě výsledků získaných v druhém experimentu byly pro stabilitní studii zvoleny liposomy s mírou PEGylace 5 % pro PEG2000 a 2 % pro PEG2120, jako pufr byl vybrán fosfátový pufr (PBS) (v rámci experimentu vliv míry PEGylace byl porovnáván s puferem 20 mM HEP 135 mM NaCl). V rámci studie dlouhodobého skladování se nám podařilo prokázat potenciál liposomů fungovat jako stabilní přenašeče pro terapeutika. Jelikož při měření po 28 dnech došlo pravděpodobně k narušení struktur těchto komplexů, je zřejmé, že by bylo vhodné podniknout další optimalizační kroky, jako je například použití rychlé proteinové kapalinové chromatografie (FPLC), nebo použití komerčních lipidů s inkorporovaným PEGem, pro snížení této chybovosti.

Abstract:

This bachelor thesis titled 'Optimization of the preparation of liposomal carriers for targeted transport of therapeutic nucleic acids' deals with the use of liposomal nanocarriers and the mechanism of RNA interference by means of siRNA in targeted therapy. The aim of this work was to optimize the preparation of complex of liposomes, polyethylene glycol and siRNA for further research, and to write an expert treatise of the issue. In the experimental part of this work, cationic liposomes were prepared from a mixture of lipids in a molar ratio of 20:50:10:20 (DODAG, DOPE, cholesterol, CPA·HCl), into which a control siRNA was encapsulated after their extrusion. Further, two types of polyethylene glycol, PEG2000 and PEG2120, were attached to the liposomal surface. The experimental part of this work consisted of three main experiments: monitoring the effect of encapsulated siRNA amount, monitoring the effect of PEGylation rate and a stability study of liposomes stored for 3 months. At the end of this work, selected samples of liposomes were imaged by scanning electron microscope. In each experiment, size, PDI and ζ potential were measured using dynamic light scattering. In the experiment, where the effect of volume of encapsulated siRNA was studied, we observed a slight increase in size with increasing amount of encapsulated siRNA. Based on results in the second-mentioned experiment, liposomes with the PEGylation rate of 5% containing PEG2000 and the PEGylation rate of 2% containing PEG2120 were selected for the stability study as well as phosphate-buffered saline (PBS) (the effect of PEGylation rate was also compared with samples prepared in 20 mM HEPES + 135 mM NaCl buffer). In a long-term storage study, we were able to demonstrate the potential of liposomes to be used as stable carriers for therapeutics. However, given that the structures of these complexes appeared to be disintegrated after 28 days, further optimization steps, like use of fast protein liquid chromatography (FPLC) or use of lipids with PEG already incorporated in their structure are needed in order to reduce the error rate.

Abstract:

Táto bakalárska práca s názvom „Optimalizace přípravy lipozomálních nosičů pro cílený transport terapeutických nukleových kyselin“ sa zaoberá využitím lipozomálnych nanoprenášačov a mechanizmu RNA interferencie prostredníctvom siRNA v cielenej terapii. Cieľom tejto práce bolo optimalizovať prípravu komplexu lipozómov, polyetylénkglykolu a siRNA pre ďalší výskum a vypracovať odbornú rozpravu o tejto problematike. V rámci praktickej časti tejto práce boli pripravené kationické lipozómy zo zmesi lipidov v molárnom pomere 20:50:10:20 (DODAG, DOPE, cholesterol, CPA·HCl), do ktorých bola po extrúzií enkapsulovaná kontrolná siRNA a na ich povrch boli naviazané dva druhy polyetylénglykolu: PEG2000 a PEG2120. Praktická časť tejto práce pozostávala z troch hlavných experimentov, ktorými boli: sledovanie vplyvu množstva enkapsulovanej siRNA, sledovanie vplyvu miery PEGylácie a stabilitná štúdia dlhodobého skladovania lipozómov po dobu troch mesiacov. V závere tejto práce boli vybrané vzorky lipozómov vyfotografované na skenovacom elektrónovom mikroskope. Vo všetkých experimentoch bola pomocou dynamického rozptylu svetla sledovaná veľkosť, PDI a ζ potenciál. V experimente, ktorý sa zaoberal vplyvom množstva enkapsulovanej siRNA, sme zaznamenali so zvyšujúcim sa množstvom siRNA nárast veľkosti. Na základe výsledkov získaných v druhom experimente boli pre stabilitnú štúdiu zvolené lipozómy s mierou PEGylácie 5 % pre PEG2000 a 2 % pre PEG2120, ako pufer bol vybraný fosfátový pufer (PBS)(v rámci experimentu vplyv miery PEGylácie bol porovnávaný s puferom 20 mM HEPES + 135 mM NaCl). V rámci štúdie dlhodobého skladovania sa nám podarilo preukázať potenciál lipozómov fungovať ako stabilné prenášače pre terapeutiká. No keďže pri meraní po 28 dňoch došlo pravdepodobne k narušeniu štruktúr týchto komplexov, je zrejmé, že by bolo vhodné podniknúť ďalšie optimalizačné kroky, akým je napríklad použitie rýchlej proteínovej kvapalinovej chromatografie (FPLC), alebo použitie komerčných lipidov s inkorporovaným PEGom, pre zníženie tejto chybovosti.

Klíčová slova

liposomy, nanomedicína, nanopřenašeče, siRNA, RNA interference

Keywords

RNA interference, Nanomedicine, Liposomes, siRNA, nanocarriers

Klíčová slova

RNA interferencia, nanomedicína, lipozómy, siRNA, nanoprenášače

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 7. 6. 2022
• Vedoucí: Ing. Simona Rex, Ph.D.
• Oponent: Barbora Tesařová, externi

Mendelova univerzita v Brně

Agronomická fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Agrobiologie / Molekulární biologie a biotechnologie