Molekulárne mechanizmy progresie karcinómu prostaty

Mgr. Alena MIČKOVÁ

Doctoral thesis

Molecular Mechanisms of Prostate Cancer Progression

Abstract:

Rakovina prostaty (PCa) patrí k najčastejšiemu onkologickému ochoreniu u mužov západného sveta a radí sa k najčastejšej onkologickej príčine ich úmrtia. Z tohto dôvodu je potrebné lepšie pochopiť progresiu ochorenia a priniesť tak nové možnosti ich liečby. Zvýšená prítomnosť Skp2, ako podjednotky E3 ubikvitín ligázového komplexu, bola opakovane zistená u agresívneho karcinómu prostaty a tento poznatok reprodukovala aj naša štúdia. Zároveň sme pozorovali koreláciu medzi Skp2 a Slug, jedným z regulátorov epitelovo-mezenchymálnej tranzície (EMT). Táto korelácia bola silnejšia u nádorov s vyšším Gleasonovým skóre v porovnaní s menej agresívnymi nádormi, ako aj u pacientov s metastázami do lymfatických uzlín v porovnaní s lokalizovaným ochorením. Multiplexnou imunohistochemickou analýzou nádorového tkaniva prostaty bola preukázaná ich vzájomná koexpresia, pričom prítomnosť oboch proteínov bola potvrdená aj v súbore prostatických mezenchymálnych línií odvodených od ich epiteliálnych náprotivkov (PC3, DU145 a E2). Chemickou inhibíciou Skp2, ale nie siRNA interferenciou, dochádzalo k čiastočnému poklesu Slug proteínu u PC3 a v ich docetaxel-rezistentnej sublínii PC3 DR12. Aktivita Skp2 v E3 ligázovom komplexe je tiež regulovaná prostredníctvom nedylácie. Použitím jej inhibítoru MLN 4924 dochádzalo k nárastu p27Kip1, typického substrátu Skp2, a k poklesu expresie Slug u PC3, PC3 DR12 a LAPC4 buniek. Tieto výsledky naznačujú možnosť využitia cielenej liečby na Skp2 a Slug prostredníctvom blokovania nedylácie u pokročilého karcinómu prostaty. Expresia Slug je výrazne modulovaná počas karcinogenézy a množstvo prác popisuje jeho zvýšenú prítomnosť v pokročilých formách rakoviny. Zároveň je prítomný v bazálnych kmeňových bunkách a naša nedávna analýza normálnej myšacej prostaty ukázala, že bazálne Slug+ bunky majú vyšší potenciál pre rast organoidov ako populácia Slug negatívnych buniek. Prítomnosť fúzneho génu TMPRSS2-ERG spolu so stratou nádorového supresoru PTEN boli zvažované ako potenciálne prediktory pre terapiu PARP inhibítormi. V našom súbore pacientov sme pozorovali signifikantnú asociáciu TMPRSS2-ERG so zníženou expresiou PTEN. Aj keď klinické štúdie s veliparibom nepreukázali lepšie prežívanie pacientov s fúznym génom, iné experimentálne modely naznačujú, že strata PTEN môže inhibovať homológnu rekombináciu a senzitizovať nádory k PARP inhibícii aj rádioterapii v nádoroch bez BRCA mutácií. Ďalej sme sa zameriavali na ustanovenie pacientských in vitro 3D organoidov a krátkodobej ex vivo tkanivovej kultúry s cieľom ich možného vyžitia v personalizovanej liečbe pokročilého karcinómomu prostaty. Celkovo sa nám organoidy podarilo kultivovať z 58% nádorového (29/50) a 69% nenádorového (20/29) tkaniva. Imunohistochemickým farbením pan-cytokeratínu u dvoch reprezentatívnych vzoriek sme preukázali rast epiteliálnych buniek, ale nadexpresia AMACR a ERG u nádorového tkaniva nebola zachovaná v príslušných organoidov. Ďalším obmedzením tohto prístupu bol rast organoidov len po dobu 3 týždňov do prvej pasáže. Okrem toho sme využili techniku tkanivových kultúr ex vivo a vykonali krátkodobý chemoterapeutický test s použitím gemcitabínu a inhibítora Chk1 v 10 vzorkách pacientov. Nekonzistentná morfológia medzi fragmentmi tkaniva a nízka proliferácia vo väčšine prípadov bránili interpretácii testovania liečiv. Napriek tomu môžu byť tieto prístupy sľubné pri použití metastatických tkanív kastračne rezistentnej rakoviny prostaty

Abstract:

Prostate cancer (PCa) is one of the most common male cancers in the Western world and is one of the most common causes of cancer-related death. For this reason, it is necessary to better understand the progression of the disease and thus bring new possibilities for their treatment. The increased presence of Skp2 as a subunit of the E3 ubiquitin ligase complex has been repeatedly found in aggressive prostate cancer and this finding was reproduced in our study. At the same time, we observed a correlation between Skp2 and Slug, one of the regulators of epithelial-mesenchymal transition (EMT). This correlation was stronger in tumors with a higher Gleason score compared to less aggressive tumors, as well as in patients with lymph node metastases compared to localized disease. Multiplex immunohistochemical analysis of prostate tumor tissue demonstrated their mutual co-expression, while the presence of both proteins was also confirmed in a set of prostatic mesenchymal lines derived from their epithelial counterparts (PC3, DU145, and E2). Chemical inhibition of Skp2, but not RNA interference, resulted in a partial decrease in Slug protein in PC3 and in their docetaxel-resistant subline PC3 DR12. Skp2 activity in the E3 ligase complex is also regulated by neddylation. Using its inhibitor MLN4924, there was an increase in p27Kip1, a typical Skp2 substrate, and a decrease in Slug expression in PC3, PC3 DR12 and LAPC4 cells. These results suggest the possibility of using a targeted treatment for Skp2 and Slug by blocking neddylation in advanced prostate cancer. Slug expression is markedly modulated during carcinogenesis and several studies have described its increased presence in advanced cancers. It is also present in basal stem cells and our recent analysis of normal mouse prostate has shown that basal Slug+ cells have a higher potential for organoid growth than a population of Slug negative cells. The presence of the TMPRSS2-ERG fusion gene with the loss of the tumor suppressor PTEN were suggested as potential predictors for PARP inhibitor therapy. In our group of patients, we observed a significant association of TMPRSS2-ERG with reduced PTEN expression. Although clinical studies with veliparib did not show better survival in patients with the fusion gene, other experimental models suggest that PTEN loss may inhibit homologous recombination and sensitize tumors to PARP inhibition and radiotherapy in tumors without BRCA mutations. We also focused on establishing patient-derived in vitro 3D organoids and short-term ex vivo tissue culture for their potential use in the personalized treatment of advanced prostate cancer. Overall, we were able to culture organoids from 58% tumor (29/50) and 69% non-tumor (20/29) tissue. We demonstrated epithelial cell growth by immunohistochemical staining of pan-cytokeratin in two representative samples, but overexpression of AMACR and ERG in tumor tissue was not retained in the respective organoids. Another limitation of this approach was the growth of organoids for only three weeks until the first passage. In addition, we used ex vivo tissue culture and performed a short-term chemotherapeutic test using gemcitabine and a Chk1 inhibitor in ten patient samples. Inconsistent morphology between tissue fragments and low proliferation in most cases hindered the interpretation of drug testing. Nevertheless, these approaches may be promising when using metastatic tissues of castration-resistant prostate cancer.

Keywords

rakovina prostaty, Skp2, Slug, TMPRSS2-ERG, organoidy, ex vivo tkanivová kultúra

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 1. 2022

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Jan Bouchal, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Biology / Medical Biology