Vývoj bioelektrochemických metod pro in vitro diagnostiku nádorových onemocnění

Mgr. Ludmila Moráňová, Ph.D.

Doctoral thesis

Development of bio-electrochemical methods for in vitro diagnostics of malignant diseases

Abstract:

I přes značný pokrok vědy a medicíny ročně onemocní a podlehne nádorovým onemocněním celosvětově několik milionů lidí. Navzdory úspěchu na poli léčby všeobecně platí, že čím dříve se nemoc odhalí, tím lépe je léčitelná. Nejen tomuto cíli slouží použití nádorových biomarkerů, přičemž však jejich detekce v nejrůznějších biologických vzorcích přináší řadu výzev a problémů pro přesné stanovení jejich hladin. Detekce biomarkerů na úrovni nukleových kyselin, tj. DNA nebo RNA, je časově i finančně náročná a často vyžaduje přesnost stanovení jednoho mutovaného nukleotidu nebo detekci několika málo kopií DNA molekul. Z těchto důvodů je patrný výrazný trend ve vývoji biosenzorů, které by byly schopné rychlého a přesného měření. Ve spojení s cílovou elektrochemickou detekcí skýtají řadu výhod, např. rychlost, finanční nenáročnost, a vysokou citlivost a specificitu detekce díky kombinaci různých elementů jako jsou izotermální amplifikační techniky, značené nukleotidy, protilátky, nanomateriály, specifické hybridizační sondy a různé elektrochemické techniky měření. Stanovení přítomnosti lidského papilomaviru patří mezi významné diagnostické biomarkery, obzvlášť pro karcinom děložního čípku. Přesto až do nedávna nebylo toto stanovení implementováno do národního preventivního screeningového programu, ačkoliv celosvětové studie dokazují přínos tohoto stanovení. Proto se část této práce věnuje právě vývoji metody pro přesnou detekci tohoto onkoviru a snaží se vytvořit přesnou metodu, která je dostatečně senzitivní a specifická v DNA izolované z cytologických stěrů a také v komplexních lyzátech bez nutnosti separace DNA. Další části práce se věnují stanovení biomarkerů na úrovni RNA a to konkrétně krátkých nekódujících miRNA, a RNA biomarkerům v moči, indikujících přítomnost karcinomu prostaty. Pro diagnostiku karcinomu prostaty bylo vybráno stanovení PSA na úrovni mRNA a PCA3 patřící mezi dlouhé nekódující RNA. Poměr těchto biomarkerů dokáže přesněji stanovit přítomnost maligního onemocnění prostaty a omezit tak zbytné biopsie prostaty. Námi prezentované výsledky ukazují možnost širokého využití elektrochemických metod v klinické praxi pro detekci nádorových biomarkerů na úrovni nukleových kyselin.

Abstract:

Despite significant progress in science and medicine, millions of people worldwide are diagnosed and succumb to malignant diseases. Despite the improvement in the cancer treatment, it is generally accepted that the sooner the disease is diagnosed, the better prognosis. For this purpose, various tumor biomarkers are used, although their detection in a variety of biological samples poses a number of challenges and problems for accurate level determination. Detection of nucleic acids biomarkers is time- and money-consuming, and often requires accurate determination of a single nucleotide mutation or detection of ultralow quantities of DNA. For these reasons, there is a strong emphasis to develop biosensors that can deliver fast and accurate results. In connection with the end-point electrochemical detection, the electrochemical biosensors offer numerous advantages, e.g. high speed, low cost, and high sensitivity and specificity thanks to the combination of various elements such as isothermal amplification techniques, labeled nucleotides, antibodies, nanomaterials, specific hybridization probes, and different electrochemical measurements. Determination of the presence of human papillomavirus is an important diagnostic biomarker, especially for cervical cancer. Until recently, however, HPV testing was not included in Czech national preventive screening program, despite its benefits demonstrated by worldwide studies. Therefore, part of this thesis is devoted to the development of a highly sensitive and specific method for accurate detection of this oncovirus, using samples of DNA isolated from cervical swabs, or in complex cellular lysates without the need for DNA extraction. The next part of this work is focused on RNA biomarker detection, namely short non-coding microRNAs, and RNA prostate cancer urine biomarkers. For the prostate cancer diagnostics, the determination of PSA at the level of mRNA and PCA3 belonging to long non-coding RNA was chosen. Ratio of these two biomarkers could accurately determine prostate cancer from urine and thus reduce unnecessary prostate biopsies. The results presented by us show the possibility to apply electrochemical methods into clinical practice for the detection of tumor biomarkers at the nucleic acid level.

Keywords

nádorový biomarker, HPV, elektrochemie, biosenzor, izotermální amplifikační techniky, LAMP, cancer biomarker, electrochemistry, biosensor, isothermal amplification techniques

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 1. 2022

Thesis defence

• Date of defence: 17. 2. 2022
• Supervisor: Mgr. Martin Bartošík, Ph.D.
• Reader: Mgr. Zdeněk Farka, Ph.D., prof. Ing. Jan Vacek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics