Identifikace genomovarů Burkholderia cepacia komplexu pomocí molekulárních metod

Mgr. Lucie Navrátilová

Rigorózní práce

Identification of genomovars of Burkholderia cepacia complex by help molecular methods

Anotace:

Burkholderia cepacia označuje komplex geneticky příbuzných druhů, tzv. genomovarů, z taxonomického hlediska toto pojmenování slouží pro zjednodušení v klinické praxi. V současné době je známo 17 genomovarů. Není to tatáž Burkholderia cepacia, která je zodpovědná za hnilobu cibule a současně za až fatální “cepacia syndrom“ popsaný u pacientů trpící cystickou fibrózou. Z klinického pohledu druhy náležející k Burkholderia cepacia komplexu patří mezi původce nosokomiálních nákaz a nositele rezistence k většině β-laktamových antibiotik. U lidí se nejčastěji vyskytují genomovary I až V (Burkholderia cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis a B. vietnamiensis). Rozlišení genomovarů není možné pomocí fenotypových metod, proto zde mají svůj význam molekulárně-genetické metody. Pro rozlišení genomovarů Burkholderia cepacia komplexu byly použity a porovnány 1) semi-specifická PCR zacílená na 16S/23S rDNA; 2) genomovar specifická PCR zacílená na gen recA; 3) univerzální PCR zacílená na gen recA s následnou analýzou RFLP amplikonů; 4) genomovar specifická PCR v jednoduchém a multiplex provedení s následnou analýzou křivky tání PCR produktů. Analýza 16S/23S rDNA podle očekávání neumožnila rozlišit genomovary I až V náležejících ke komplexu. Analyzované fragmenty 16S/23S rDNA nedosahovaly dostatečné variability. Přímo bylo možné rozlišit pouze genomovary II (B. multivorans) a V (B. vietnamiensis). Genomovar I (B. cepacia) tvořil dvojici s genomovarem III (B. cenocepacia) nebo IV (B. stabilis). Analýza genu recA ve všech uspořádáních umožnila rozlišení pěti testovaných genomovarů. Celkem bylo analyzováno 145 klinických kmenů Burkholderia cepacia komplexu získaných od pacientů Fakultní nemocnice Olomouc v letech 2011 – 2013, nejvíce byl zastoupen genomovar II (B. multivorans). Genomovarizace je dnes založena na PCR s genomovar recA specifickými primery. Automatizovaná, rychlá a přesná genetická identifikace genomovarů Burkholderia cepacia komplexu je potenciálně velkým přínosem pro pacienty s oslabenou imunitou. Genomovar specifická PCR v provedení jednoduchém i multiplex s následnou analýzou křivky tání může zkrátit čas potřebný na identifikaci bakterie a snížit riziko kontaminace, nicméně si vyžádá validaci na rozsáhlém souboru vzorků se zastoupením všech genomovarů.

Abstract:

Burkholderia cepacia denotes complex of genetic related, species called genomovars, from a taxonomical point of view, this name is, used for simplifiction in the clinical practice. Currently there are known 17 genomovars. It's not the same Burkholderia cepacia, which is responsible for rotting onion and simultaneously fatal "cepacia syndrome" described in patients suffering from cystic fibrosis. From a clinical point of view, the Burkholderia cepacia complex ranks among agens responsible for nosocomial infections and carrier of the resistance to most β-lactam antibiotics. In humans mostly occur genomovary I to V (Burkholderia cepacia, B. multivorans, B. cenocepacia, B. stabilis and B. vietnamiensis). Distinction of genomovars is not possible by using phenotypic methods, that´s why molecular-genetic methods have their signification here. For resolution of genomovars of Burkholderia cepacia complex were used and compared 1) semi-specific PCR aimed at 16S/23S rDNA; 2) genomovar specific PCR aimed at gene recA; 3) univerzal PCR aimed at gene recA with the following RFLP analyse of amplicons; 4) genomovar specific PCR in simplex and multiplex execution with the following analyse of melting curve of PCR products. Analysis of 16S/23S rDNA did not allow to distinguish genomovars I – V belonging to the complex. The analysed fragments of 16S/23S rDNA had not enough variability. Directly it was possible to distinguish only genomovars II (B. multivorans) and V (B. vietnamiensis). Genomovar I (B. cepacia) was sorted into pair with genomovar III (B. cenocepacia) or IV (B. stabilis). Analysis of the gene recA in the all configurations eneabled distinguish of five tested genomovars. Altogether 145 clinical strain of Burkholderia cepacia complex obtained from patients of Faculty hospital Olomouc in years 2011 – 2013 were analysed, the most was represented by genomovar II (B. multivorans). Genomovarization is today based on PCR with genomovar recA specific primers. Automated, fast and accurate genetic identification of genomovars of Burkholderia cepacia complex is potentially great benefit to patients with weakened immune systems. Genomovar specific PCR in simplex and multiplex execution with the following analyse of melting curve can shorten time needed to bacterial identification and reduce risk of contamination, nevertheless it requires validation of extensive set of samples with representation of all genomovars.

Klíčová slova

Klíčová slova, analýza křivky tání, PCR, RFLP, recA, 16S/23S rDNA

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 9. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 17. 1. 2014
• Oponent: doc. RNDr. Leona Buňková, Ph.D., MVDr. Oto Melter, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Rigorózní řízení / obor:
Experimentální biologie / Speciální biologie